ADDP细胞凋亡及其机制的研究样本

1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。A549/DDPa胞凋亡及其机制的研究1材料1.1 主要仪器荧光显微镜及照相系统：Olympus公司垂直电泳槽：Bio-Rad公司电转移槽：Bio-Rad公司恒温摇床：江苏太仓仪器公司分光光度仪：Bio-Rad 公司遥控酶标仪：TECAN公司台式高速离心机：eppendorf 公司其余同前两部分1.2 普通耗材50mL/250mLffl胞培养瓶：Nunc公司6孔细胞培养板：Costar公司60mmffl胞培养皿：Costar公司细胞刮刀：Nunc公司1.3 主要试剂Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司PI 和 Annexi

2、n V-FITC: 美国 BD公司TUNELM齐1J盒：罗氏公司鼠抗人 Caspase-8 p10 单抗：Cell SignalingHRPfc记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司BCA?t蛋白定量试剂盒：Pierce 公司ECL发光检测试齐1J盒:Pierce公司硝酸纤维素转移膜(0.22 m m)Amershanfr司DABzl匕京中杉公司其余试剂同前两部分资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。1.4 常见缓冲液及培养基结合缓冲液(x 10):100 mmol/L HEPES(PH 7.5)1.4 moL NaCl25 mmol/L CaCl2单去土亏剂裂解液：50 mmo

3、l/L Tris-HCl(PH 8.0)150 mmol/L NaCl1%TritonX-100100 g/mL PMSF5XSDSS白上样缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8)10%SDS50%t 油0.5%S酚蓝500 mmol/L DTT(临用前现加)电泳缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4)250 mmol/L 甘氨酸(PH 8.3)0.1%SDS转移缓冲液：5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4)120 mmol/L甘氨酸0.1%SDS20刈醇(V/V)储存于4 c备用PBSS冲液资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请

4、联系改正或者删除。137 mmol/L NaCl2.7 mmol/L KCl10.0 mmol/L Na2HPO42.0 mmol/L KH2PO4调节至PH=7.4洗涤缓冲液(PBS-Tween-20):1000 mL PBS(PH7.4,0.01M)500 仙 L Tween-20封闭缓冲液：5 g脱脂奶粉100 mL PBST1.5细胞系同第一部分2方法2.1 A549/DDP细胞凋亡的检测2.1.1 细胞凋亡形态学观察将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1X 104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、 40 mol

5、/L的培养液继续培养24 h后终止培养，取出细胞爬片，按照 Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。在细胞爬片上，轻轻滴加约500仙L固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分 钟。去固定液，用PBSfc两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动数次。去染色液，用PBSfc两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细月fi的盖玻片，让细胞接 触封片剂，避免气泡。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。上荧光显微镜观察，激发波长350nm,发射波长4

6、60nm2.1.2 原位末端标记（TUNEL跺色同上方法制备细胞爬片,PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL试剂盒说明书操作。在细胞爬片上，轻轻滴加约500仙L固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定30分 钟。PBSgfc片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴加内源性过 氧化物酶阻断剂（0.3%H2O2邛醇溶液），室温孵育30分钟。同上用PBSSfc片，滴加通透液（0.1%TritonX-100 溶于0.1%枸檬酸钠溶液中）， 在冰浴中孵育2分钟。PBSgfc两次，滴力口50仙L的TUNE反应混合液，湿盒中室温孵育60分钟。PBSgfc两次，滴力口 50仙L的转化剂-POD,湿盒

7、中37c孵育30分钟。PBSgfc两次，加入DAB物溶液，室温孵育10分钟。PBSgfc两次，封片。光镜下观察。结果判定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观察500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数（apoptotic index,AI）。2.1.3 流式细胞仪（FCM瀚测细胞凋亡取对数生长期A549/DDFa胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。接种于直径60mms养皿中，每孔4mL,细胞培养箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40N mol/L的培养液，继续培养24h。常规消化，4 C离心（800rpm,5min）,

8、收获各组细胞，转移至1.5mL离心管。弃上清，加入预冷的1X结合缓冲液100 nL,重悬细胞，置于冰浴。加入5 L Annex in V-FITC 和5 L PI于细胞悬液中，混匀，4 C避光染色10min。补加490仙L结合缓冲液混悬细胞，立即行FC泌析。2.2 姜黄素对 A549/DDFa月fi caspase-8的影响资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。取对数生长期A549/DDPM胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液，接种于直径 60mmi养皿中，每孔4mL,细胞培养箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液,加 入含姜黄素终浓度为0、5、10、20、30、40仙

9、mol/L的培养液，继续培养 24h02.2.1 样品制备提取细胞总蛋白：a.培养液中悬浮细胞蛋白的提取：各浓度姜黄素处理细胞24h后，终止培养。将 培养皿中的培养液转移至15mL塑料离心管中，4 , 2500rpm离心10min,弃上 清，4C1XPBSgfc涤两次，加入单去污剂裂解液100仙L于冰上裂解30min,将上 消转移至1.5mL塑料离心管，备用；b.贴于培养皿上细胞蛋白的提取：4C1XPBSa涤培养皿两遍，加入单去污剂裂 解液300仙L于冰上裂解30min。裂解完毕后，用细胞刮片将细胞刮于一侧，转 移至1.5mL塑料离心管中,4 C , 1 rpm 离心10min。c.将离心后的

10、上清液与从a中得到的裂解上清混合,4 C , 1 rpm 离心5min,取 上清分装于0.5mL离心管中，置于20C备用。BCAt蛋白定量。取总蛋白含量相等的上清体积，加入1/5体积的5X SDS上样缓冲液，沸水煮 5min, 1 rpm 离心 10min,备用。2.2.2 电泳采用微型垂直蛋白电泳系统进行 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲系统为 Tris-甘氨酸电泳缓冲液。先后配制10%勺分离胶及4%勺浓缩胶，凝固后用微量 加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质标准，电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压120V,当染料前沿进入分离胶后，把电压提至160V,继续电泳 至澳酚蓝到达分离胶的底

11、部，关闭电源。2.2.3 转移将电泳后的SDS-PAG胶板置于转移缓冲液中平衡15min,再在转移缓冲液中进 行电转移；将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，恒压60V,冷却系统中转移2h。转移资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。完成后将膜在丽春红染液中染色，观察电转结果。剪下目的蛋白部分，做好标记, 放入双蒸水中漂染，褪去染液颜色。2.2.4 Western blot封闭：将膜置于平皿中，加入封闭液于室温缓慢摇动1h。与一抗孵育：将鼠抗人Caspase-8 p10单抗及B -actin 作为一抗用PBS#释 (1:1000),与膜共同封入塑料袋中，4 C过夜。洗膜：将膜从塑料

12、袋中取出，PBST振摇漂洗3次，每次10min。与二抗孵育：将HRPB记羊抗鼠抗体作为二抗用 PBSTffi释(1:3000),与膜共 同封入塑料袋中，室温缓慢摇动1h。洗膜：同。化学发光：将膜上液体用滤纸吸干，置于化学发光底物反应系统中反应5min,暗室X-光片15min。显影20sec,定影10min.扫描后，用LeicaQwin图象分析软件进行吸光度积分值分析。2.3 统计学处理用SPSS11.0统计软件包处理，统计学方法采用单因素方差分析，SNK-q检验，x2 检验，P 0.05认为有统计学意义。3结果3.1 A549/DDP细胞凋亡的检测3.1.1 细胞形态学改变荧光显微镜下观察，姜

13、黄素组部分细胞的细胞核均有破裂，呈大、小不等，被 荧光染料着色成致密浓缩发白发亮的细胞核，此为典型的细胞凋亡形态。其中以 40仙mol/L姜黄素组最多，对照组只见很少凋亡形态细胞(附图1)。3.1.2 TUNEL检测细胞凋亡指数原位DNAM口末端标记染色，凋亡细胞核呈棕黄色，易于识别(附图2)。0, 5、l0、20、30、40 仙 mol/L 的姜黄素作用于 A549/DDPSMfi 24 h 后，凋 亡指数分别是(2.6 0.5)%、(10.7 2.3)%、(20.5 3.1)%、(28.6 3.4)%、 (35.7 0.4)%、(49.5 4.4)%,显示出明显的剂量依赖关系(P0.05)

14、。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。3.1.3流式细胞仪检测细胞凋亡率不同浓度姜黄素作用于 A549/DD醐月fi 24 h后，经Annexin-V和PI进行染色后, 用流式细胞仪分析凋亡细胞。流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方 图（图5）。第1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）,第2象限代 表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,第3象限代表正常细胞（An-PI-）, 第4 象限代表早期凋亡细胞（An+PI-）。本实验主要观察早期凋亡细胞，早期凋亡细胞 即 An+PI-细胞所占的百分比分别为 2.93%、3.68%、7.71%、20.

15、23%、23.0%、 32.15%,显示出明显的剂量依赖关系（P0.05）。3.2 Western blot 的结果不同浓度姜黄素处理 A549/DDP细胞24h后，出现Caspase8活性裂解片段P10 的蛋白条带（附图3）,且条带光密度积分值随姜黄素浓度而增强（图6）。4讨论细胞凋亡是细胞生物体的一种重要的自稳机制，是由体内外因素触发细胞内预 存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。研究表明，月中瘤的发生很可能就是由于细胞增殖和凋亡失衡，导致肿瘤细胞无限无序增殖所致。诱导月中瘤细胞凋亡是许多 抗癌成分十分重要的抗癌机制之一。月中瘤化疗过程中，凋亡细胞很快被体内的巨 噬细胞清除，对周围的炎症反应很少。因此经过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具有更 少的毒副反应，当前经过诱导或促进月中瘤细胞凋亡正成为月中瘤防治的新思路，也是评估抗癌药物作用能力的重要指标。细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。本部分实验中，经过不 同浓