二烯丙基二硫化物对HL60白血病细胞株VEGF表达及分泌的影响

1、二烯丙基二硫化物对HL-60白血病细胞株VEGF表达及分泌的影响 作者：谢熠，范自力，姚晨姣，谭三勤，赵亚丽【摘要】 为了研究二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide，DADS）对白血病HL-60细胞株VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白分泌的作用，并从影响VEGF生成的角度探讨DADS的抗白血病机制，应用ELISA法检测药物作用前后白血病HL-60细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量； RT-PCR法检测药物作用前后白血病HL-60细胞VEGF mRNA的相对含量。结果表明： HL-60细胞中均有VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白的分泌；与空白对照相比，DADS 3个浓度组（

2、0.625，1.25，2.5 g/ml）作用HL-60细胞48小时和72小时均能下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌（P<0.01）。3个浓度组间差异显著（P<0.01），其下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌效果与浓度相关（r>0.9，P<0.01）。结论： DADS可能通过抑制VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌发挥抗白血病效应。 【关键词】 二烯丙基二硫化物Effect of Diallyl Disulfide on Expression and Secretion of

3、VEGF in HL-60 Leukemic CellsAbstract The study was aimed to investigate the expression of VEGF mRNA and VEGF protein in HL-60 cells treated with diallyl disulfide (DADS)，and to explore the antileukemic mechanism of DADS in respect of VEGF production.Semi-quantitative RT-PCR and ELISA were used to de

4、tect the expression of VEGF mRNA and secretion of VEGF protein in HL-60 cell lines treated by DADS respectively. The results showed that the expression of VEGF mRNA and secretion of VEGF protein were found in HL-60 cells.The expression of VEGF mRNA and secretion of VEGF protein in HL-60 cells could

5、be down regulated by treatment with 0.625，1.25，and 2.5 g/mL DADS for 48 and 72 hours and the effects had a dose dependent relationship（r>0.9，P<0.01）.The differences between DADS treated HL-60 cell groups and the control group were statistically significant （P<0.01），there were al

6、so statistically significant differences among three DADS-treated HL-60 cell groups（P<0.05）. It is concluded that DADS effectively inhibits the proliferation of human leukemia cell line HL-60 cells; DADS exerts its antileukemic effects by reduction of the expression of VEGF mRNA and VEGF prot

7、ein secretion.Key words diallyl disulfide; HL-60 cell; leukemia; vascular endothelial growth factor 全反式维甲酸（ATRA）已成为治疗急性早幼粒白血病的首选药物，但也有其局限性，并且还会发生维甲酸综合征不良反应，因此寻找毒副作用低的抗白血病的药物仍是当前研究的重要课题。已有研究证明，大蒜中的一种脂溶性的有效成分二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide，DADS）对乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌和白血病等细胞均有抑制作用1-3，但其作用机制尚未明了。本研究初步探讨DA

8、DS对HL-60白血病细胞株抑制作用的可能机制。材料和方法细胞系及试剂人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞，由中南大学湘雅医学院细胞中心提供。RPMI 1640培养液为美国Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品。DADS为美国Fluka公司产品，相对分子质量为146.28，纯度为80% 含10%-20% 二烯丙基硫醚(DAS) ；Tween 80为华美公司产品；全反式维甲酸为美国Sigma 公司产品，相对分子质量为300.44，纯度98 % 。TRIZOL购自美国Gibco BRL公司；cDNA合成试剂盒、dNTP、 TaqDNA聚合酶均购自晶美生物技术有限公司，为美国F

9、ermentas公司产品；电泳用琼脂糖为德国Promega公司产品；RULERTM DNA 100 bp ladder产品购自晶美公司；VEGF ELISA试剂盒购自晶美生物公司。VEGF引物由上海博亚生物工程服务有限公司合成，引物序列参见文献1 。VEGF(Genbank 登录号: NM-003376) 上游引物： 5-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3，下游引物： 5-CCTGGTGAG-AGATCTGGTTC-3，根据mRNA剪切位点的不同，扩增产物为516、588、648 bp长度片段。-actin (Genbank 登录号: NM-001101)上游引物： 5-ATCTGG

10、CACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3，下游引物: 5-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-CTGC-3，扩增产物837 bp 。细胞培养及细胞处理将HL-60 细胞悬浮培养于含10 %胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37、5 % CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2-3天传代1次。取对数生长期的细胞，调整细胞悬液终浓度为2×106/ml 。实验设为6组，1-3 组为不同浓度(0.625、1.25、2.5 g/ ml) DADS组，4 组为试剂对照(RPMI 1640)对照组；5 组为溶媒Tween 80对照组；6 组为ATRA（浓度为1

11、.5g/ ml）阳性对照组。每组2瓶。每50 ml培养瓶加入细胞数为5×106的细胞悬液、不同浓度的药物、 RPMI 1640培养液，每瓶培养体积为5 ml，放置于37、 5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48、72小时。收集各时相细胞上清液，保存于1.5 ml EP管中，-20 保存。 各时相细胞5×106个装入1.5 ml EP管中，-70保存，待抽提总RNA。细胞培养上清液VEGF蛋白水平的测定VEGF蛋白水平采用定量ELISA法测定。酶标仪上读取每孔的OD450值(5分钟内)取复孔浓度的平均值。细胞VEGF mRNA表达的RT-PCR检测细胞总RNA提取按TRIZ

12、OL一步法提取细胞总RNA。电泳鉴定RNA的质量，紫外分光光度仪定量。逆转录反应取上述制备的RNA样品1 l进行逆转录，20 l逆转录体系包括：总RNA样品1 l，Oligo(dT)18 0.5 g/l×1 l，用DEPC水补至体积12 l 后，70 变性5分钟，冰上骤冷，加入5×Rt缓冲液4 l，dNTP 10 mmol/L×2 l，RiboLockTM Ribonuclease inhibitor 20 U/l×1 l，37温育5分钟，加入RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase 200 U/l×1 l

13、，42温育60分钟。结束反应后，70变性10分钟，冰上骤冷10分钟，用于扩增或-20保存。逆转录反应产物扩增取上述逆转录反应产物2.0 l，于20 l反应体系中行PCR扩增。 反应体系(20 l)包括：10 ×PCR 缓冲液2.0 l，25 mmol/L MgCl2 1.6 l，10 mmol/L dNTP 0.4 l，5 U/l Taq DNA 聚合酶0.4 l，VEGF上游及下游引物各0.2 l或-actin上游及下游引物各0.2 l，逆转录产物cDNA 2.0 l，灭菌双蒸水补足20 l 。瞬时离心，置于PCR 扩增仪上，预变性95 2分30秒后，94变性40秒，60退火40秒

14、，72延伸40秒，共32个循环，最后72 5分钟结束反应，4保存。PCR扩增反应产物琼脂糖凝胶电泳15 g/L琼脂糖凝胶加入终浓度为0.5 g/ml的溴化乙锭，取上述PCR 扩增反应产物5 l、溴酚蓝上样指示剂1 l，加入到凝胶的点样孔中，每次取6 l电泳，在100 V电压电泳约1小时。取出凝胶，在紫外反射透射凝胶图像分析仪上观察电泳结果并照相。通过扫描取复管电泳条带灰度的平均值，根据VEGF 与-actin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。统计学分析所有数据均以均数±标准差( ±SD)表示。采用SPSS 11.0计算机软件对所得数据进行分析，两样本间比较用配对t检验

15、，多组样本均数间比较用单因素方差分析，双因素相关分析，两两之间多重比较：方差齐用LSD检验、方差不齐用Dunnett T3检验。P>0.05为差异无统计学意义，P<0.05为差异有统计学意义。结果二烯丙基二硫化物对HL-60 细胞分泌VEGF蛋白的影响结果如表1所示。3种浓度DADS及全反式维甲酸作用48 小时和72 小时后细胞上清液中VEGF浓度与空白对照比较，显著减低(P0.01），表明0.625、1.25 和2.5 g/ml的DADS及1.5 g/ml全反式维甲酸作用HL-60细胞48小时和72小时可抑制HL-60 细胞分泌VEGF。3种DADS药物浓度之间比

16、较，差异具有显著性(P0.01），干预同一时间点后DADS抑制HL-60细胞分泌VEGF的作用随浓度的升高而增大（r绝对值均>0.9，P0.01），但Tween 80对HL-60 细胞分泌VEGF无影响（P0.05）。全反式维甲酸与3种药物浓度之间比较差异显著(P0.01）。Table 1.VEGF protein in HL-60 cell lines treated by DADS（略）DADS对HL-60 细胞VEGF mRNA表达的影响3种浓度的DADS作用于白血病HL-60细胞48小时、72小时后，细胞VEGF mRNA与内参照-action条带灰度比值结果如表2所示。

17、从表2中可以看出，0.625、1.25、2.5 g/ml的DADS作用HL-60细胞48小时、72小时，VEGF灰度比值与对照组相比显著降低(P0.01)，即0.625、1.25、2.5 g/ml的DADS处理HL-60细胞48小时和72小时，可明显下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达(P0.01)。各药物浓度组差异显著(P0.01)，VEGF mRNA相对表达量与DADS浓度负相关（r绝对值均>0.9，P0.01），即其下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达随浓度的升高而增大。作用HL-60细胞72小时全反式维甲酸与1.25 g/ml的DADS下调HL-60细胞VEG

18、F mRNA的表达作用相近(P0.05)。Table 2.Expression of VEGF mRNA in HL-60 cells treated with DADS (略)PCR产物琼脂糖凝胶电泳部分结果结果如图1、2所示，HL-60细胞表达VEGF mRNA的3种片段，即516 bp、588 bp和648 bp，分别是3种异构体VEGF121、VEGF145、VEGF165 mRNA的扩增产物，HL-60细胞以VEGF121的表达最强。在同一时间点上随作用药物浓度的升高，VEGF条带与-actin条带丰度比值下降。讨 论VEGF可以刺激新生血管的产生，通过自分泌和旁分泌途径促进自身的增

19、殖，VEGF可能作为一种旁分泌因子影响着白血病细胞自身的生物学效应4。大量的临床研究证明，VEGF在各类型的白血病细胞中均有高表达，且是影响白血病发生发展及预后的独立因素之一，寻找能抗VEGF产生的药物在白血病的治疗中就具有十分重要的意义。 DADS是大蒜中一种有效的脂溶性成份，具有抑制白血病细胞生长、诱导白血病细胞分化、促进白血病细胞凋亡作用。为进一步探讨DADS抑制白血病细胞增殖的机制，我们用ELISA法检测了不同浓度DADS作用48小时、72小时后白血病细胞培养液中VEGF的含量，用RT-PCR法检测VEGF mRNA相对量的变化，从而从蛋白及转录水平上探讨DADS对白血病细胞分泌VEG

20、F及VEGF mRNA表达的影响。结果表明：经DADS处理过的HL-60 细胞，其VEGF的表达及分泌被抑制（P0.01)，因而认为其抑制白血病细胞生长途径之一可能是抑制人HL-60细胞VEGF基因的表达。我们的这一结果与2001年国内学者高艳景等5的研究相似，他们用大蒜素（主要成分为二烯丙三硫占40 %以上，其次为DADS 6）处理人肝癌细胞株BEL7402 8小时，结果发现大蒜素有明显抑制人肝癌细胞VEGF mRNA表达的作用，与对照组相比，VEGF mRNA表达水平降低了约66.36 %(P<0.05) 。Shukla等7用大蒜中另一种提取物二烯丙基硫醚（diallylsu

21、lfide，DAS）作用携艾氏腹水瘤裸鼠，发现裸鼠的瘤体内微血管密度明显降低，认为DAS抗癌机制之一是抑制肿瘤血管生成。结合他们的研究，我们认为大蒜中的抗癌有效成分含硫化合物（DADS、大蒜素、二烯丙基硫醚）具有抗血管生成的作用，但它们作用的大小不清楚。我们用2.5 g/ml DADS处理HL-60 细胞48小时，VEGF mRNA表达水平降低了约23.8 %(P0.01），小于10 g/L大蒜素对肝癌细胞的抑制。这种差异可能与药物作用的细胞种类及作用药物的成分有关。大蒜素能降低肝癌细胞VEGF mRNA表达，DADS可能起了一定的作用。 DADS抑制白血病细胞分泌VEGF的机制可能与DADS

22、的诱导分化作用有关。DADS诱导白血病细胞分化，使白血病细胞部分转变成正常单个核细胞，从而导致分泌血管内皮细胞生长因子的能力下降。在VEGF的调控中肿瘤抑制基因的失活或突变可导致VEGF 在肿瘤细胞中的过度表达，如VHL基因、p53基因的失活。而癌基因ras、raf或src 的突变或扩增可启动VEGF 转录，使表达上调8，9。Ras 基因突变频繁发生于许多癌症中，这种突变可永久性地启动信号转导通路而引起肿瘤发生。在NIH313 细胞株与突变H-ras 基因转染模拟体外致瘤实验中，口服DADS可呈剂量依赖性抑制NIH313细胞生长，阻碍可测量肿瘤的形成。这种抑制作用与DADS抑制了肿瘤细胞膜相关

23、P21 蛋白有关，从而抑制了Ras P21 蛋白活化，进而抑制了ras基因的突变10。因此，我们认为DADS能降低HL-60白血病细胞VEGF的分泌及表达可能与它抑制基因的突变有关。在本实验中，我们分析DADS对HL-60细胞分泌VEGF的影响时，选择的药物浓度低于4 g/ml。 Kwon 等3报道，DADS在约25 mol/L (4 g/ml) 时开始诱导凋亡，即我们选择的药物浓度低于DADS诱导凋亡的浓度，结果提示DADS可抑制肿瘤细胞表达血管内皮细胞生长因子，因此我们认为，DADS在低浓度时降低HL-60细胞VEGF的表达与其诱导凋亡的关系可能不大。DADS抑制VEGF的促血管新生可能是

24、DADS抗肿瘤的又一种可能机制。 我们的实验表明，化学保护剂DADS可抑制白血病细胞VEGF的表达及分泌，从而可削弱VEGF对血管内皮细胞的旁分泌作用，因而具有抗血管新生的活性。由于DADS无明显的骨髓抑制作用，但具有抗血管新生的活性，故推测其与放疗、化疗相结合，将会增强放疗、化疗的疗效，减少后者的用量，降低毒性，有助于白血病的治疗。但是我们的研究仅限于体外肿瘤细胞系的实验，整体动物体内及人体内的治疗效果尚有待进一步验证。另外，DADS下调白血病细胞VEGF分泌及表达的机制尚未明确，需进一步研究阐明。【参考文献】 1Gupta N，Porter TD.Garlic and garlic-der

25、ived compounds inhibit human squalene monooxygenase.J Nutr，2001; 131：1662-16672Robert V，Mouille B，Mayeur C，et al.Effects of the garlic compound diallyl disulfide on the metabolism，adherence and cell cycle of HT-29 colon carcinoma cells:evidence of sensitive and resistant sub-po-pulations.Carcinogenesis，2001;22:1155-11613Kwon KB，Yoo SJ，Ryu DG，et al.Induction of apoptosis by diallyl disulfide through activa