乙肝病毒对早孕绒毛MMP2及9表达水平的影响

1、乙肝病毒对早孕绒毛MMP-2及9表达水平的影响【摘要】目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)对早孕绒MMP-2及9表达水平的影响。方法 收集HBsAg阳性早孕绒毛组织，采用免疫组织化学SP法和western blot检测HBV对绒毛组织MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的影响。结果 HBV感染病毒的绒毛组织未见明显病理改变；MMP-2蛋白主要在早孕绒毛EVT胞浆表达，VT、ST及间质有少量表达；MMP-9蛋白主要在早孕绒毛间质、EVT和VT胞浆表达，ST少量表达。与正常对照组相比，病毒组中早孕绒毛组织中两种蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 HBV降低早孕绒毛MMP-2和M

2、MP-9蛋白表达。 【关键词】乙型肝炎病毒 绒毛外细胞滋养细胞 MMP-2 MMP-9 自然流产 【Abstract】 Objective The effect of Hepatitis B virus (HBV) on expression of early pregnant villi. Methods Pregnant villous tissue of HBsAg positive were obtained，MMP-2 and MMP-9 protein of villous tissue were detected by immunocytochemical staining an

3、d western blot. Results The villous tissue was not obviously changed; MMP-2 protein primarily expressed in early pregnancy villous EVT endochylema and rarely in villous trophoblast (VT)，ST and interstitial cells; MMP-9 protein largely expressed in early pregnancy villous mesenchyme，EVT and VT endoch

4、ylema. Compared with control group，the three kinds of protein expression level in early pregnancy villus of virus group significantly decreased (P<0.05). Conclusion The expression of MMP-2 and MMP-9 proteins were inhibited by HBV. 【Key words】 Hepatitis B virus extravillous cytotrophoblast MMP

5、-2 MMP-9 Spontaneous abortion 乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus,HBV) 母婴传播是导致人群中众多HBV携带者及相关性疾病的重要原因。我国妊娠妇女乙肝表面抗原(HBsAg)的阳性率为10%-15%，宫内感染是母婴传播的主要途径，HBV宫内传播与自然流产存在一定关系1。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)，特别是MMP-2和MMP-9，对胎盘形成及胎儿发育有重要影响2。因此我们收集孕早期HBsAg阳性孕妇的绒毛组织，分析HBV对 绒毛MMP-2和MMP-9表达水平的影响，初步探讨HBV导致自然流产的机制。 1

6、材料和方法 1.1材料 1.1.1标本来源 2010.3-2011.3在泰安市中心医院就诊，由妇产科和感染科确诊HBsAg阳性早孕妇86例为病毒组，HBV-DNA定量103-9，年龄(22.3±3.3)岁；对照组：为同期就诊经超声确诊为早孕HBsAg阴性患者36例，年龄(23.0±4.6)岁。两组患者均为自愿人工流产510周绒毛组织(本研究遵循程序符合泰安市中心医院人体试验委员会所制定的伦理学标准，得到其批准，并取得受试对象的知情同意)，且年龄及妊娠时间无显著性差异。 1.1.2试剂 兔抗HBsAg、MMP-2和MMP-9多克隆抗体(武汉博士德)，SP免疫组化试剂盒（北京中

7、杉），总蛋白提取试剂盒（BestBio-贝博生物），-actin内参抗体（北京博奥森）等。 1.2方法 1.2.1标本制备：绒毛组织提取蛋白，-70冰箱保存或10%福尔马林缓冲液固定24h，石蜡包埋，切片，片厚3um。 1.2.2免疫组织化学：取两组切片常规处理后，行免疫组织化学SP法检测。分别加适当浓度兔抗HBsAg、MMP-2和MMP-9多克隆抗体，4过夜，次日加标记碱性磷酸酶的羊抗兔IgG，37孵育1h，以DAB显色，苏木素复染细胞核，中性树胶封片。光镜下观察，棕黄或棕褐色颗粒为阳性。利用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像处理，高倍镜下随机观察10个视野，测量阳性表

8、达的细胞平均光密度值，进行半定量统计学分析。 1.2.3Western blot检测：参照试剂盒说明书，分组提取总蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度，每个样品取50g行10SDS-PAGE，湿转移至PVDF膜上，5脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入兔抗MMP-2和MM-P9多克隆抗体，4孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗，室温孵育2h，TBST洗膜，ECL试剂显色，凝胶成像仪下曝光显影，用Quantityone凝胶图像分析软件检测各组目的蛋白及其内参-actin蛋白的吸光度值，以目的条带与内参蛋白平均吸光度的比值表示目的蛋白水平。 1.3统计学分析 应用SPSS 130统计软件，数值以S

9、77;X表示，组间差异进行独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1病毒组绒毛组织感染情况：早孕乙肝患者绒毛感染率为30.2%（26/86）。HE染色绒毛组织未见明显的病理损害。免疫组织化学染色显示HBs Ag主要表达于各类型滋养细胞及间质细胞，呈散在或聚集分布于受感染细胞的胞浆和细胞膜中,少量表达于细胞核。 2.2MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化：如图1、2，免疫组织化学染色见MMP-2蛋白主要在早孕绒毛外细胞滋养细胞浆表达，绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞及间质有少量表达。MMP-9蛋白主要在早孕绒毛间质、绒毛外细胞滋养细胞和绒毛细胞滋养细胞浆表

10、达，合体滋养细胞少量表达，病毒组两种蛋白表达水平明显低于正常组（P<0.05）； Western-blot法中，在72kDa和92kDa处检测到目的条带，比较其灰度值发现，乙肝病毒感染绒毛组织的该两种蛋白表达均明显降低（P<0.05），见图3、4。 3 讨论 乙型肝炎是具有严重危害性的世界性传染疾病，中国是乙型肝炎的高发区，HBsAg携带者约有1.2 亿人，慢性乙型肝炎患者约2000万，其中妊娠妇女HBsAg阳性率为10%15%，HBsAg携带者至少有40%是由母婴传播造成的，宫内感染是母婴传播的重要途径3，但其具体机制尚未完全清楚。 胎盘绒毛前期阶段的大量滋养细胞

11、发育为胎盘的绒毛，这些滋养细胞形成绒毛的CT和ST。绒毛膜绒毛是胎盘唯一具有胎儿和母体两个循环、双重血供的成分，其上皮的表层被ST覆盖，直接与母血接触，其功能如内皮。合体结节是在ST表面聚集一群核为特征的特殊化合体滋养细胞群，在未成熟胎盘中，合体结节是附在未成熟中间型或间叶性绒毛上，是绒毛发芽和生长的标志。在ST与基膜间是绒毛的CT，或称朗汉细胞，是ST的干细胞，维持其生长和再生。滋养细胞的基膜将滋养细胞从绒毛的基质分开。EVT是胎盘所有包括细胞柱等非绒毛部分发育的基本物质，可分为增生、间质及侵袭三种表型，其中细胞柱的干细胞为后来的侵袭提供滋养细胞，并未固定绒毛的CT起到生长带作用，EVT镜下

12、为圆形到多边形，以单核细胞为主的细胞。在我们试验中，由于HBV感染时间短，因此绒毛组织未出现明显病理性改变。 在胚胎植入发育过程中，EVT侵袭蜕膜及子宫浅肌层，进行生理性重构子宫螺旋动脉，是成功妊娠的必要条件。EVT侵袭功能下降，可导致病理性妊娠发生。胎盘形成、EVT侵袭过程主要受三方面影响，首先与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的结合，然后在迁移方向上降解ECM，最后迁移并穿过ECM完成迁徙侵袭过程。期间EVT需要可降解ECM的蛋白酶，MMP是主要关键酶类之一，它们在各类型滋养细胞呈特异性和时间性分布，并且受母胎界面的物理环境、ECM组分变化、多种生长因子和细胞

13、因子、激素等共同作用通过调节MMP/基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）系统的平衡，控制细胞滋养层细胞的增殖、分化和侵袭。其中，明胶酶MMP-2和型胶原水解酶MMP-9是介导EVT侵入的主要MMP4。 在整个妊娠期间EVT均表达MMP-2，但晚孕胎盘中几乎检测不到酶活性，而早中孕期EVT高表达MMP-9，晚孕期消失，即随着绒毛侵袭功能减退，MMP-2和MMP-9的酶活性也随之消失5。MMP活性的调节很复杂，且建立在不同的水平。它们的表达依赖其基因启动子的各种顺式元件，可以被各种可溶性的因子诱导或抑制。在表达和分泌后，前MMPs必须通过激活系统激活，然后酶活性被抑制子或稳定子调控6。目前MMP-

14、2和MMP-9参与胎盘形成的具体机制尚不清楚。我们试验结果显示，MMP-2蛋白主要在早孕绒毛EVT胞浆表达，而MMP-9蛋白主要在早孕绒毛间质、EVT和VT胞浆表达，与Isakaa等7研究基本相符。当HBV感染绒毛后两种蛋白表达水平显著降低，提示HCMV通过直接或间接作用打破MMPs/TIMP系统平衡，引起MMP-2和MMP-9合成、分泌降低，导致EVT侵袭功能异常。 综上所述，HBV的复制和增殖，引起滋养层细胞的细胞周期阻滞，影响以上三种蛋白合成分泌减少，进而导致EVT侵袭功能下降，可能是HBV宫内感染致流产、早产、胎儿生长发育受限等产科疾病的机制之一。 参 考 文 献 1 Nguyen G

15、，Garcia RT，Nguyen N,et al. Clinical course of hepatitis B virus infection during pregnancy. Aliment Pharmacol Ther. 2009,29(7):755-64. 2 Tao L，Suhua C，Juanjuan C，et al.In vitro study on human cytomegalovirus affecting early pregnancy villous EVTs invasion function.Virol J. 2011,8:114. 3 Zhang L，Zhan

16、g W，Shao C，et al.Establishment and characterization of a spontaneously immortalized trophoblast cell line (HPT-8) and its hepatitis B virus-expressing clone.Hum Reprod. 2011，26(8):2146-56. 4 Ioannidis I，Dimo B，Karameris A,et al. Comparative study of the immunohistochemical expression of metalloproteinases 2，7and 9 between clearly invasive carcinomas and "in situ" trophoblast invasion.Neoplasma. 2010，57(1):20-8. 5 Isaka K，Usuda S，Ito H，et al.Expression and activity of matrix metalloproteinase 2 and 9 in human trophoblasts.Placenta,2003,24(1): 5364. 6 Co