Rapamycin和cyclosporinA对同种排斥过程中TLR5及Foxp3表达的影响

1、Rapamycin和cyclosporin A对同种排斥过程中TLR5及Foxp3表达的影响 作者：陈富强, 曲莉莉, 张超, 梁婷, 宋静, 徐佳, 侯桂华【摘要】 目的: 研究雷帕霉素（Rapamycin, RAPA）和环孢素A（cyclosporin A, CsA）体内处理对同种移植小鼠急性排斥过程中TLR5及Foxp3表达的影响。方法: 建立同种皮肤移植模型, 术后给予RAPA或CsA, 1次/d, 连续14 d, 同时设生理盐水对照组。每日观察移植物存活状况。术后选取1、 7、 10、 14、 21 d共5个时间点, 提取受体小鼠脾细胞, RTPCR检测TLR5及Foxp3 mRNA

2、表达, 探讨不同处理组基因表达与移植物生存的相关性。体外实验利用鞭毛蛋白（flagellin）联合RAPA和CsA处理正常小鼠T细胞6 h, RTPCR检测TLR5表达。结果: RAPA和CsA可明显延长小鼠同种移植皮片存活期。RAPA可促进脾细胞TLR5 mRNA表达升高, 停药后的第21天仍明显高于CsA组和对照组（P0.05）; CsA组在第7、 10天有显著升高, 第21天降低（P0.05）; 3组中最高表达的时间点为移植后第10天, 此时正值排斥高峰期。RAPA可引起Foxp3 mRNA的表达升高（P0.05）, 停药后仍维持较高水平; CsA组仅在移植后第7、 10天短暂升高, 第

3、14天低于对照组（P0.05）。移植后1、 7、 10、 21 d 3组的TLR5与Foxp3 mRNA变化趋势正相关。体外实验中, RAPA或CsA与flagellin联合使用, 可促进TLR5的表达, 以前者的作用更为明显。结论: RAPA和CsA在同种移植急性排斥高峰期可引起TLR5和Foxp3表达的协同升高, 且RAPA的作用更加明显和持久, 鞭毛蛋白体外可以增强这种作用效果。 【关键词】 雷帕霉素; 环孢素A; 同种移植; TLR5; Foxp3; 鞭毛蛋白CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）在维持外周免疫耐受, 调控T细胞免疫应答, 预防移植排斥中起重要作用。转录因子Foxp

4、3是Treg的特征性标志, 对其功能的诱导起关键作用。研究证实Treg高表达TLR4、 TLR5、 TLR7和TLR8, 其中TLR5活化能够增强Treg细胞抑制功能, 同时可使Foxp3表达增加, TLR5的特异配体鞭毛蛋白可增强Treg对效应性T细胞的抑制作用。但是同种移植状态下, TLR5的表达状况及移植物生存关系的研究鲜见报道。研究移植排斥过程中TLRs对Treg细胞的调节机制, 对探讨Treg的免疫抑制机制以及信号转导通路具有重要的意义。 免疫抑制药物雷帕霉素 (Rapamycin, RAPA)和环胞素A(cyclosporin A, CsA)广泛用于器官移植后抗移植物排斥反应, 并

5、且在实验模型中作为诱导免疫耐受的工具。目前使用的免疫抑制药物可以通过抑制效应性T细胞的扩增防止移植物的排斥, 但是是否可以诱导激活Treg细胞以及其分子机制仍需要进一步阐明。CsA抑制TCR介导的T细胞激活和IL2的产生, 而RAPA阻断T细胞生长因子细胞内信号转导, 因此 CsA和RAPA对CD4+CD25+Treg可能有不同的作用1。研究表明RAPA在体外可以选择性地扩增CD4+CD25+调节性T细胞, 而不阻断其他类型T细胞的扩增和活化, 诱导细胞凋亡2。 我们前期的研究证实RAPA和CsA体内处理可以明显增加同种移植受体的Treg比例, 增强Foxp3的表达。但是即使体内使用RAPA,

6、 同种移植个体中的Treg比例仍然处于较低水平3。如何通过调节Treg细胞活性, 在体内扩增Treg细胞, 更好地诱导同种移植耐受仍是亟待解决的问题。2008年有研究报告4, 体内给予TLR5特异配体flagellin, 可以保护机体免受化学、 病毒和辐射等损害。鉴于TLR5的表达有助于免疫保护的形成, 我们推测同种移植个体的TLR5的活化可能有助于Treg的激活和移植耐受的形成。因此利用RAPA和CsA处理小鼠同种移植模型, 研究急性排斥过程中体内TLR5及Foxp3表达量的动态变化趋势, 探讨在急性同种移植排斥过程中TLR5和Foxp3表达与移植物生存的关系及两种抗排斥药物的作用, 旨在为

7、利用TLR5特异配体和RAPA进行同种移植耐受诱导奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 BALB/c小鼠(H2d), 由山东大学实验动物中心提供; C57BL/6 (H2b, B6)小鼠, 由上海实验动物中心提供。以上小鼠均为雌性, 812周龄, 均饲养在恒温(2527)、 恒定湿度(45%55%)无特殊病原菌(SPF级)环境中。RAPA购自美国Sigma公司, CsA 购自Novartis Pharama公司, RTPCR及PCR试剂盒购自TaKaRa公司, Foxp3、 TLR5引物及GAPDH引物由博尚生物技术服务有限公司合成。副伤寒杆菌鞭毛蛋白flagellin (本室参照文献5制备）

8、。12 方法121 小鼠同种移植模型制备 参照文献6进行。制备全厚度小鼠躯干皮肤移植物并行移植术。脱椎法处死供体小鼠（B6）, 取全厚度躯干部皮肤, 去除皮下脂肪及血管, 剪成1 cm2大小的皮片备用。然后给受体BALB/c小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 g/g体质量）行麻醉术, 在小鼠右背部制备移植床, 将供体皮片置于移植床, 包扎固定后逐日观察移植物排斥状况。当移植皮片坏死达50%时, 即为完全排斥。122 实验分组及模型的耐受诱导 将移植过皮片的BALB/c小鼠随机分为3组, 每组15只。对照组: 术后腹腔注射生理盐水, 0.2 mL/只, 连续14 d; CsA处理组: 术后注射CsA,

9、 10 mg/(kg·d), 连续14 d; RAPA处理组: 术后腹腔注射RAPA, 1.5 mg/(kg·d), 连续14 d（此时对照组移植皮片全部排斥掉, 故停药）。123 TLR5及Foxp3 mRNA的表达 分别于移植后第1、 7、 10、 14、 21天, 取实验组对照组小鼠脾脏, 提取脾细胞, 采用异硫基氢酸胍（TRIzol）一步法提取细胞总RNA, 半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）对转录产物进行扩增, 以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参对照。1 TAE制备15 g/L的琼脂糖凝胶, 加入浓度为0.5 mg/L的溴化乙啶（EB）染色。取PCR反

10、应产物10 L与2 L上样缓冲液混合后点样于凝胶孔电泳, 以相对分子质量（Mr）2 000的Marker做标准判断PCR产物片段大小, 恒压5 V/cm电泳50 min, 然后用凝胶扫描仪在A260波长紫外光下观察并扫描。用FR200UV/WHITE ANALYSIS及Photo Impact SE系统对电泳结果作图像分析。实验结果以检测条带与GAPDH条带的总灰度值的比值作为待测目的片段的相对值。124 flagellin联合RAPA、 CsA体外处理对TLR5的影响 通过小鼠T淋巴细胞纯化柱（Mouse T Cell Enrichment Columns）纯化BALB/c小鼠脾脏T细胞,

11、106/孔接种于24孔培养板上; 加入B6小鼠可溶性同种抗原6, 实验分6组: 对照组（不加任何药物处理）、 flagellin组（100 g/L）、 RAPA（15 mg/L）组, CsA组（15 mg/L）, flagellin（100 g/L）+RAPA（15 mg/L）组、 flagellin（100 g/L）+ CsA组（15 mg/L）; 每组3个复孔, 37、 50 mL/L CO2培养箱中培养6 h后收集细胞, RTPCR检测TLR5表达量, 用FR200UV/WHITE ANALYSIS及Photo Impact SE系统对电泳结果作图像分析, 以检测条带与GAPDH条带的总

12、灰度值的比值作为待测目的片段的相对值。125 统计学分析 计量资料以x±s表示, 采用SPSS12.0统计软件进行数据分析, 进行t检验和方差分析, P0.05为差异有统计学意义。2 结果21 RAPA及CsA对同种移植皮片存活时间的影响 与对照组（13.2±1.5 d）相比, 雷帕霉素组（22.8±2.1 d）和CsA组(22.0±1.9 d)移植皮片的存活时间均明显延长, 有统计学意义(P0.05, 图1)。雷帕霉素组和CsA组间虽然无统计学意义, 但CsA组小鼠一般生存状态较差。22 RAPA及CsA诱导对TLR5及Foxp3 mRNA表达的影响

13、（1）TLR5 mRNA表达状况: 如图2所示, 与对照组相比, 同种移植后, 特别是第1、 7、 10、 21天, RAPA体内处理组脾细胞TLR5 mRNA表达明显上调（P0.05）。而CsA处理组的TLR5表达在第7、 10天有明显升高, 第21天明显下降。此时低于对照组（P0.05）。3组中的TLR5 mRNA表达最高的时间点是同种移植后第10天, 此时正值排斥高峰期。（2）Foxp3 mRNA的表达变化: 未处理组同种移植后第10天Foxp3表达显著升高, 此后迅速下降, 第14天恢复至正常水平（图3）。CsA组移植后第7天开始升高, 第10天达到高峰（P0.05）, 第14天明显下

14、降; RAPA组移植后第1天的Foxp3表达明显升高, 第10、 14天达到高峰（P0.05）, 第21天仍明显高于未处理组和CsA组; 移植后第7天, 第10天的RAPA组和CsA组的Foxp3表达无显著差异（P0.05）。但是CsA组移植后第14天Foxp3表达较RAPA组显著下降（P0.05）。结果提示RAPA处理组的Foxp3表达持续升高可能是其延长移植物存活时间的机制之一。图1 RAPA和CsA对同种移植皮片存活时间的影响（略）Fig 1 Effect of RAPA and CsA on the survival time of allograft图2 RAPA和CsA对同种移植受

15、体TLR5 mRNA表达的影响（略）Fig 2 Effect of RAPA/CsA on the expression of TLR5 mRNAaP0.05 vs control.23 TLR5与Foxp3基因表达的相关性 如图4所示, 同种移植后TLR5和Foxp3的表达均在排斥高峰期（移植后第10天）升高最明显, 之后Foxp3的表达迅速下降, 而TLR5的表达持续移植后14 d才开始下降。而体内给予CsA后, TLR5和Foxp3的表达第7天就明显升高, 第10天达到高峰, Foxp3在第14天恢复至起始水平, 而TLR5在第21天恢复至起始水平（图5）; RAPA体内处理组的TLR5

16、和Foxp3的表达从移植后就开始同步升高, 第10天达到高峰, 第21天恢复至初始水平（图6）。统计学分析显示, 小鼠皮片急性移植排斥期1、 7、 10、 21 d, 移植受体脾细胞的TLR5与Foxp3变化趋势明显正相关, 且免疫抑制药物CsA与RAPA均显著上调它们的表达, RAPA上调效果最为明显。图3 RAPA和CsA对同种移植个体Foxp3 mRNA表达的影响（略）Fig 3 Effect of RAPA/CsA on the expression of Foxp3 mRNAaP0.05 vs control.图4 同种移植排斥过程中TLR5与Foxp3基因表达的相关性（略）Fig

17、4 Relationship of TLR5 and Foxp3 mRNA expression during allorejection图5 CsA 对同种移植排斥过程中TLR5与Foxp3基因表达的影响（略）Fig 5 Effect of CsA on expression of TLR5 and Foxp3 mRNA during allorejection24 T细胞体外培养后TLR5的表达 与对照粗相比, 小鼠脾T细胞体外培养6 h后, flagellin处理组、 flagellin+RAPA联合处理组、 flagellin+CsA联合处理组的TLR5 mRNA均明显高表达（P0.0

18、5）, 其中flagellin+RAPA联合处理组增高更明显, 而单独用CsA处理、 RAPA处理组的TLR5 mRNA无统计学意义。图6 RAPA对同种移植排斥过程中TLR5与Foxp3基因表达的影响（略）Fig 6 Effect of RAPA on expression of TLR5 and Foxp3 mRNA during allorejection图7 flagellin, RAPA和CsA对小鼠T细胞TLR5表达的影响（略）Fig 7 Effect of flagellin, RAPA and CsA on expression of TLR5 of T cellsaP0.05

19、 vs control.3 讨论 迄今为止发现的TLRs家族多数对免疫应答起激活增强作用, 如TLR2、 TLR4等, 而TLR5作为一种特殊的TLRs, 对免疫应答具有负调节作用。目前发现TLR5的唯一配体是细菌鞭毛蛋白（flagellin）。因此选择TLR5, 研究其在同种移植排斥中的表达及意义, 可以为利用flagellin诱导移植耐受奠定实验基础。随着近年来对Treg作用机制研究的日益深入, 越来越多的证据证实在机体正常及疾病状态下, 病原相关分子模式（PAMPs）可通过Toll样受体调节CD4+CD25+调节性T细胞的增殖及功能。如, TLR2缺陷小鼠CD4+CD25+调节性T细胞数

20、量明显减少, 且TLR2的配体能够在体外培养中促进其增殖, 表明TLR2对于调节性T细胞的扩增和和抑制活性的维持非常重要; 小鼠CD4+CD25+调节性T细胞选择性的高水平表达TLR1、 2、 4、 5、 7和8, 且LPS可与CD4+CD25+Treg上TLR4结合增强Treg细胞抑制能力, 小鼠CD4+CD25+调节性T细胞表面TLR4的配体能够增强细胞的抑制能力; 与此不同的是TLR8的配体能够直接作用于CD4+CD25+调节性T细胞, 并降低其抑制能力7。因此, 不同TLRs对CD4+CD25+调节性T细胞具有不同作用。CD4+CD25+T细胞高表达TLR4及TLR5 mRNA, 作为

21、一种协同刺激分子, TLR5可能通过影响Foxp3的表达而增强CD4+CD25+调节性T细胞的抑制能力。 CsA和RAPA都是临床器官移植患者的常用药, 可以减少免疫细胞的增殖和活化, 进而抑制移植排斥反应。二者联合使用能减少肾移植术后急性排斥反应的发生率, 然而这两种药物对Treg的影响却不同。肾移植病人, 术后使用RAPA, 体内Treg的比例与健康人无显著差异, 明显高于术后使用CsA组8。 本研究证实, 同种移植急性排斥高峰期, TLR5和Foxp3表达升高, 给予CsA与RAPA, 对移植受体TLR5和Foxp3表达的影响不同, 二者虽然都可引起移植排斥高峰期的TLR5和Foxp3表

22、达升高, 但RAPA作用更强, 尤其是引起Foxp3表达持续升高, CsA也可促进这两种基因的表达, 但持续时间较短。提示RAPA抗移植排斥的机理之一可能是通过激活Treg发挥作用。体外研究结果提示, flagellin可以激活T细胞的TLR5表达, RAPA可以加强这一作用, 因此有望利用flagellin联合RAPA进行移植耐受的诱导。至于flagellin通过什么样的信号途径, 其与RAPA作用途径是否有交叉, 及相互影响的进一步意义等, 这些诱人的问题尚待研究。【参考文献】 1 Coenen JJ, Koenen HJ, van Rijssen E, et al. Rapamycin,

23、 and not cyclosporin A, preserves the highly suppressive CD27+ subset of human CD4+CD25+ regulatory T cellsJ. Blood, 2006, 107(3): 1018-1023.2 Battagia M, Stabilini A, Roncarolo MG, et al. Rapamycin selectively expands CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cellsJ. Blood, 2005, 105(15): 4743-4748.3 郑永先, 侯桂华, 宋 静, 等 雷帕霉素对同种移植耐受模型CD4+CD25+T细胞活性的影响J 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23（4）: 327-3304 VijayKumar M, Aitken JD