罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序doc

1、罗氏公司 TUNEL 细胞凋亡检测程序作者： Roche发表于： 2009-03-0614:54来源：丁香园（In situcelldeathdetectionkit-POD 法）一、 原理：TUNEL（TdT-mediateddUTP nick end labeling ）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。其原理是荧光素（ fluorescein ）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme ）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（ HRP ，horse-radishpero

2、xidase ）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP 底物二氨基联苯胺（ DAB ）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞， 因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞； 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3-OH 形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本 （石蜡包埋、冰冻和超薄切片） 和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。 还可应用于抗肿瘤药的药效评价， 以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、 器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；

3、试剂：试剂盒含 TdT 10×、荧光素标记的 dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP ；自备试剂： PBS 、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（ 100 、95 、90、80、70% ）、DAB 工作液（临用前配制， 5 l 20× DAB+1 L 30%H2O2+94 l PBS ）、 Pr oteinase K 工作液（ 10- 20 g/ml in 10 mM Tris/HCl ， pH 7.4-8 ）或细胞通透液（ 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodiumcitrate ，临用前配制）、苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml

4、3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5 ， 10mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。三、 实验步骤操作流程图： 制作石蜡切片 脱蜡、水合 细胞通透 加 TUNEL 反应液 加 converter- POD 与底物 DAB 反应显色 光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤：1. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min ；2. 用梯度乙醇（ 100 、95 、90、 80、70% ）各浸洗 1 次，每次 3min ；3. PBS 漂洗 2 次；4. 用 Proteinase K 工作液处理组织 15-30 min 在 21 37°C（温度、时间、浓度均需

5、摸索）或者加细胞通透液 8min ；5. PBS 漂洗 2 次；6. 制备 TUNEL 反应混合液，处理组用 50 l TdT+450 l 荧光素标记的 dU TP 液混匀；而阴性对照组仅加 50 l 荧光素标记的 dUTP 液，阳性对照组先加入 100l DNase 1，反应在 1525 ×10min ，后面步骤同处理组。7. 玻片干后，加 50 l TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加 50 l 荧光素标记的 dUTP 液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ×1h。8. PBS 漂洗 3 次；9. 可以加 1 滴 PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光

6、波长为450500nm ，检测波长为 515565nm ）；10. 玻片干后加 50 l converter -POD 于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 37×30min 。11. PBS 漂洗 3 次；12. 在组织处加 50100 lDAB 底物，反应 1525 ×10min ；13. PBS 漂洗 3 次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染， 几秒后立即用自来水冲洗。 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴 PBS 或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计 200 500 个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断 （未染色细胞变

7、小，胞膜完整但出现发泡现象， 晚期出现凋亡小体， 贴壁细胞出现邹缩、 变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）四、 注意事项1. 进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 min 。2. PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行， 这样可以使反应液均匀分布于样本整体， 又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL 反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果 20×DAB 溶液颜

8、色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用甲基绿（ Methyl Green ）染液（ 3-5% 甲基绿溶于 0.1M 醋酸巴比妥PH4.0 ）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100% 乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用8090% 的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 荧光素标记的 dUTP 液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20 （ -1525 ）； converter-POD 液一旦解冻，以后就保存在4（ 28）下，至少在 6 m 内稳定，避免再次冻存； TUNEL 反应液临用前配好后，放至冰上