拟南芥突变体相关分析

1、 拟南芥突变体的相关研究遗传学 摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析1 拟南芥突变体的筛选拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突

2、变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。 1.1植物材料诱变以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml 重蒸水，搅拌30 分钟；在4，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封口后放在水浴（25）振荡器上振荡12h。然后用50ml 蒸馏水 漂 洗种子4 次，每次15min。将漂洗好的种子置于4下春化3天后种植。1.2诱变植株培养将经EMS诱变处理后的拟南芥种

3、子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。1.3 突变体的筛选拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10 分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS 培养基上；将培养皿置于4冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22，连续光照，光强30umol/ m2s-1。在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2

4、代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再转入含0.65% 琼脂（W/V）的MS培养基中，根尖朝下培养一周左右；然后转入含有蛭石的营养土中培养，以收获M3代种子。M3代种子再进行上述低钾条件下的根弯曲试验。若某一株系的M3代幼苗仍表现耐低钾性状，则将其确定为耐低钾突变体。2 拟南芥突变体的遗传分析M3 代突变体种子种于MS 盐培养基上, 幼苗生长5 6 d 后将其移栽于蛭石上，培养至开花，以野生型为父本，突变体为母本, 进行杂交, 得F1代。杂交试验操作程序为：（1）选择母本花。即在ros 植株主花轴顶端的花序中选择花瓣刚从花萼顶端露出的幼小的花, 小心剥去其花萼, 花瓣和雄蕊。(2)选择父本花。选

5、择完全开放的花, 花瓣与主花轴几乎垂直, 花药正处于释放花粉时期, 其表面呈颗粒状。(3)授粉。用镊子从父本植株取下花药, 授粉到准备好的母本植株柱头上, 授粉3 7 d 后, 如果杂交成功的话, 肉眼即可看到角果生成, 而杂交不成功的柱头因未授粉而萎蔫。(4)统计结果。将F1 种子种于MS 培养基上, 生长5 6采用根弯曲法检测植株对H2O2 抗性表现, 统计结果用于遗传分析。(5)结果分析选ros突变株进行自交和杂交, 检测F1和F2对H2O2 抗性。结果发现, 杂交成功的F1 用10- 4 mol/ L 的H2O2 处理幼苗, 全部不抗H2O2, 即根的生长受到抑制。而在F2 代, 不抗

6、与抗呈现3B1 的比例分离。突变体发生了隐性单基因突变。3 拟南芥的群体遗传变异研究拟南芥是一种自花授粉物种，在自然界存在的大多数为自交系。且几乎都是纯合子，拟南芥的群体遗传变异已被广泛研究。 它的表型和分子特征可以从种子开始分析，包括形态特征、同工酶标记位点( isozyme markers) 、微卫星(microsatellites) 、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 、切割扩增多型性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS) 标记, 扩增片段长度多态

7、性(Amplication Fragment Length Polymorphism Analysis, AFLP) 标记和大规模DNA测序。而多数研究集中在单拷贝核序列的多态现象。此外，拟南芥重复序列和基因家族也已被分析。包括线粒体DNA(mtDNA) 、着丝点重复序列和转座子。从所有的研究中可以得知，由于是自花授粉植物，拟南芥的群体多态性是有限的。不过，利用AFLP、CAPS 和微卫星等基因组标记， 在拟南芥中也发现了较高程度的多态现象。拟南芥中至少25 个基因已被系统地测序并在不同种类间加以比对，其数量仍在快速地增加，这些基因主要包括花序形成和分生组织发育相关基因、抗性基因和编码代谢相关

8、酶的基因。测序显示， 不同基因的核苷酸多样性范围从ATTI1 的0.0006到CLV2 的0.0558。平均多样性为0.006。从分析拟南芥12 个物种606条序列标签位点( Sequence Tagged Sites, STS) 的结果估计变异的相似度，它们与Col 野生型拟南芥序列的平均差异度是0.68%。由于二种不同群体的杂合， 拟南芥基因序列具有二态性的特点。然而，在全基因组中的等位基因似乎没有二态性，其原因也许是自然选择的结果，也可能与自花授粉有关。4 拟南芥自发突变体的表型研究在不同环境下生长的拟南芥， 其形态学和生理学特征上的变异表型可作为拟南芥不同品种的鉴定依据之一。突变表型性

9、状包括几个方面，如花形态、叶形态、分枝等。自发突变也会改变拟南芥生长过程中的一些生理特征，如种子休眠、生理周期、氮利用率等。此外， 不同自发突变体中某些生化物质含量不同。如硫代葡萄糖苷( glucosinolates) 、肌醇六磷酸.磷酸盐、代谢酶活性等。拟南芥自发突变可以抵制外界许多不良生物因子。如细菌、真菌、病毒， 昆虫和哺乳动物。抗病基因变异数目巨大， 包括多种病原体和称之为NBS- LRR( nucleotide binding site plus leucine- rich repeat)核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白的约200 种植物抗病基因中一大类。拟南芥自发突变也被

10、用来抵制非生物因子。如冻害、干旱、紫外辐射、盐害、金属毒害等。对于拟南芥自发突变的表型 ，一般有两个研究过程。通过分析自发突变，确定单个基因的功能，从根本上说，自发突变体表型取决于其野生型基因，而基因互作使一些表型只在某种遗传基因的背景上出现。因此通过自发突变表型确定基因功能非常有限。其次，通过分析拟南芥自发突变表型，进一步了解生态和进化方面的发展前景，从突变的表型和分子机理可确定特定环境下哪些等位基因发生了改变。拟南芥在花期、萌芽期、逆境中的某些特性。 反映其对特定环境的适应能力，具有重要的生态学意义。5 拟南芥人工突变体库的构建拟南芥人工突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容。 基于

11、正向反向遗传学理论的插入敲除突变技术。为此提供了强有力的手段，要获得随机插入突变体主要有两种方法: T- DNA 法和转座子法。T- DNA 插入能有效地产生大量候选基因突变体，这种人工突变体可以用于分析一个QTL 中几乎所有基因敲除后的表型。通过T- DNA 转基因拟南芥植株T2 代的遗传分析，可从中鉴定出一批能引起重要表型变异的基因。目前，一些用于拟南芥基因鉴定和功能研究的大规模突变体库， 如SALK、SAIL 等已经公开释放。玉米转座子Ac 和Ds 作为双元标签系统在拟南芥突变体库的构建中也被广泛应用，1999 年开始， 建立了大规模含独立转座系的拟南芥Ds 元件插入突变体库。至今为止，

12、拟南芥Ds 元件插入突变体库的种类和数量仍在不断增加。 如最近建立了17668 个Ds 起始位点转座突变体库。除此之外，利用基因陷阱( gene trap) 包括增强子陷阱，启动子陷阱和基因陷阱、RNA 干涉以及EMS 诱导等方法也建立了一些突变体库。人工突变体库可用于大规模筛选鉴定功能缺失性和功能获得性突变体。 如硝酸还原酶缺失等突变体的筛选，极大的促进了高等植物基础理论的研究。这一技术体系也用于水稻与油菜等重要农作物重要农艺性状基因的大规模鉴定上。6 拟南芥突变体的基因功能分析6. 1 QTL 图谱分析研究突变体首先需要对突变基因进行数量性状位点(QTL) 分析： 其次， 可利用高通量遗传

13、学结合功能基因组学的策略。 来识别特定基因及QTL 中的核苷酸多态性。由于受多基因控制及环境影响， 多数变异存在数量效应， 不同物种的分离群体表型经常呈连续变异分布。从一棵植物单一表型不能直接得知相关位点上的等位基因，但它能间接从连锁标记位点推论出。通过群体实验， 估计每个QTL 的数目及其在基因组中位置，并制作QTL 图谱。 需要下列各项步骤：( a) 建立图谱种群： ( b) 确定标记基因和某一表型：( c) 表型和基因多态标记之间的连锁分析，可利用网上软( http: ..qtsoftware.html) 。QTL 图谱完成后，控制性状变异遗传

14、基因的位点和数量、相对加性效应、不同位点基因间互作( 上位性) 、每个QTL 作用方式( 位置效应) 都可以被计算出来。绘制拟南芥QTL 图谱可利用经典的群体， 如重组自交系RILs( recombinant inbred lines, RILs) 、导入系( introgression lines, ILs) 、近等基因系( near isogenic lines, NILs) 、回交系( backcross inbred lines, BILs) 等。这些群体是纯合的， 但拷贝数、环境因素、QTL 数目都会影响表型值， 拟南芥DNA 的平均遗传距离为1.2 到12Mb。包含了240 到24

15、00 个预测的开放阅读框(ORFs) 。至今为止，拟南芥QTL 图谱中已确定了花期、肌醇六磷酸含量、抗虫性和硫代葡萄糖苷含量等QTL 基因。单核苷酸多态性( SNPs) 是指DNA 序列上的单个碱基变异。它具有分布广、多态信息量大、易于检测和统计分析等优点。 能较好用于基因图谱构建和数量性状QTL 定位研究，拟南芥中可以利用微卫星、AFLP 标记或其它技术寻找SNPs, 用于QTL 图谱的构建. 拟南芥序列多态性有关数据可从网站中获得: http: 99, 这些数据同时也促进了高通量的微卫星、基因缺失、SNP 等技术的发展。6. 2 QTN( Quantitati

16、ve Trait Nucleotide ) 分析QTL 图谱谱制作完成后的主要挑战在于找到突变的分子机制。 包括确定突变的基因和核苷酸多态性，即QTN 分析.突变体克隆QTL 位点的方法， 是利用重要位点高密度的分子标记，分析连锁重组后大量的分离子代。其原理类似于图位克隆。植物中只有有限几个QTL被克隆，而拟南芥由于遗传效率高及资源丰富等优点已被广泛研究。QTN分析主要通过两个步骤：首先，选择候选基因，通过人工诱导产生特定表型的突变体。随着T- DNA方法的改进和转化效率的提高，目前已经获得了拟南芥T- DNA 插入的突变群体库。可以从中筛选某一已知序列的基因突变。其次，通过转基因实验证实是否

17、QTL 基因.转基因后，植物显示出预期的QTL 表型效应， 再通过测序，便可得知该QTL 的DNA 序列多态性。然而，要获得精确的QTL 核苷酸序列则需要更进一步的研究。至今为止，拟南芥中已经确定约有15 种自发变异基因。其中大部分与花期、细菌昆虫病原体等性状有关，并编码光感器、转录因子、R-基因家族、硫代葡萄糖苷合成等基因蛋白。已报道了一些具突变表型的核苷酸多态现象。包括单核苷酸多态， 如CRY2 和PHYA 基因中的单个氨基酸替换FRI和PHYD基因中的缩减蛋白( truncated proteins) RPM1、MAM1 和MAM2 中的大规模跨基因缺失：FLC 中的非编码调节区域的转座

18、子插入。参考文献:1 曹树青,黄琼,魏鹏. 一个耐受镉毒害的拟南芥突变体的筛选J. 环境科学学报. 2006(02)：116-118 2 何金环,李存法,宋纯鹏. 拟南芥活性氧不敏感型突变体的筛选方法建立J. 河南农业科学. 2004(06)：26-323 何金环,董发才,安国勇,宋纯鹏. 拟南芥活性氧不敏感型突变体的筛选与特性分析J. 西北植物学报. 2002(03)：496-5044 侯仙慧,丁茂予,刘赛男,李林川,瞿礼嘉. 拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析J. 植物学报. 2009(01)5Meyers BC, Kozik A, Griego A, et al.Genome- wide analysis of NBS- LRR- encoding genes in ArabidopsisJ .Plant Cell, 2003, 15: 809- 34.6 王伟青,程红焱. 拟南芥突变体种子休眠与萌发的研究进展J. 植物学通报. 2006(06) ：61-667 郭淼,张廷婷,高建强,崔德才. 拟南芥PLD1突变体的繁殖及