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文档简介

1、west er n- bl ot -全过程-详细步骤:提蛋白:1 . PBS洗 2遍,力口 RIPA 80-100ul 含 10xcooktail.2 .在冰上刮到离心管中,在冰上裂解 20-30min.3 . 4度离心,13000rpm、10-15min 准备新的离心管、配 BCA 200ul/每孔A:B=50 : 1、96孔板加 PBS2个对照组20ul,实验组18ul.4 .取上清转移到新离心管中,记住转移的体积.5 . 96孔板中每孔加2ul蛋白液.6 .每孔加200ulA/B混合液.7 . 37度半小时.8 .测浓度以及标化用一起 在libo文件夹找模板,最后得到每组需要加的RIPA

2、以及loding buffer,还有标化后的浓度.562波长0.046斜率实验组值-对照组值/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最 好,跑胶时就可以只加10ul蛋白液蛋白含量40-80ug9 .加好对应的RIPA以及loding buffer后,煮蛋白5-15min, -20度保存.二：跑胶1 . 1.0玻板,洗干净2 .配制10%或者12%别离胶 一块胶需要5ml3 .灌别离胶,在别离胶上层灌无水乙醇4 .配制5%浓缩胶2块胶需要4ml5 .待别离胶干后,灌浓缩胶,插梳子6 .待胶干后,将胶及玻板一起放入电泳槽,拔梳子,倒入 1*running buffer 上腔灌满,下腔过电线 丝7 .

3、预电泳,100v, 10-15min8 .力口样蛋白样品及 marker 10ul, marker 5ul9 . 60v 10-20min,之后 100-110V三：转膜1 .配 transfer buffer ,用 10*transfer buffer 稀释 10倍,并力口 20%甲醇2 . transfer buffer浸泡海绵、滤纸3 . pvdf膜,甲醇泡1分钟,清水洗2次,泡在transfer buffer里20min4 .胶取出,在 transfer buffer里泡 10min5 .黑胶白膜一层海绵,2层滤纸6 .转膜100v, 1 1.5h 黑对黑,冰板,在冰里跑四：封闭、一抗、二抗1 . 5%脱脂奶粉pbst溶1h 37度2 .一抗 4 度 12h3 .pbst洗膜,3次,每次10min4 .二抗1:5000 1h 37 度5 . pbst洗膜,3次,每次10min6 .显影齐1J A和B各300ulPBST: 1000ml'PBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*running buffer ： tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至 1000ml10*transfer buffer： tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至 1000ml1

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