尿酸氧化酶Urate

1、背景尿酸氧化酶（Urate Oxidase, EC1.7.3.3）,又称尿酸酶（Uricase）是生物体喋吟降解代谢途径中的一种酶，大部分生物在喋吟的代谢过程中产生尿酸， 而尿酸酶能催化尿酸氧化为尿囊素。许多物种中均发现有尿酸酶存在，但在鸟类，爬行类动物以及高等哺乳动物（灵长类包括人类）等生物的进化过程中，尿酸酶基因发生突变，使得在这些生物体，喋吟不能被氧化为尿囊素， 而是以尿酸为终产物。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，血液中过多积累会导致痛风综合症。痛风（gout）是一组喋吟代谢紊乱所致的疾病，其临床特 点为高尿酸血症（hyperuricemia）及由此而引起的痛风性急性关节炎反复发 作、痛风

2、石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。anin with GnurNORMAL dDINT22 41 - QIHT 5FJF2 4 SYHCTflirA1 - 0丁瓜614 * flOME-JOiWT-. UftHI ACT-umc Win CATS14LS加血 COMPARISON OF R JMNT;vfirH gout a v/ithoj r* I»IR FI#FII-ia-i-ll!FI I-HaMl4lll-ll-illl KIPR即 Clutamint丫laa»MBaq pa-FPi«i4 |ipB*i&q

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4、©也用睥urtnd国bowc扇映Adew$iN什fflPrAllopurinol加的Ihi修The pathway of purine metabolism目前临床上治疗痛风的主要药物是别喋吟醇，它占领了美国95 %以上的治疗痛风药物的市场。它是尿酸代谢过程中黄喋吟氧化酶的抑制剂，与喋吟代谢物竞争性抑制黄喋吟氧化酶，使次黄喋吟及黄喋吟不能转化为尿酸，从而减少尿酸的生成。但该药的副作用也很明显，个别病人可有发热、 过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚而肝功能损害等副作用。尿酸酶可以氧化尿酸为可溶性的尿囊素，在基因工程技术发展以前，从微生物中提取尿酸酶可用于临床诊断和治疗，例如

5、产月元假丝酵母。但微生物产酶量较低，限制了其广泛应用。通过DNA重组技术高效表达酶基因是一条提高产酶量的途径。迄今为止，已有多个物种的尿酸酶基因被克隆。但是，尿酸酶仍具有蛋白质类药物的共同缺点，如在胃肠道极易被蛋白酶水解；血浆半衰期较短，需反复多次注射；并且由于大分子化合物具有免疫原性，易产生过敏反应，同时还会因局部产生抗体而减效等，这些缺点限制了尿酸酶的大围的、持续的应用。实验容尿酸氧化酶的纯化发酵菌液超声破碎盐 析DEAE离子交换SDS-PAGE尿酸氧化酶的性质研究(1)尿酸酶的动力学参数的测定(2)尿酸酶的酸碱稳定性测定(3)温度对尿酸酶稳定性的影响实验一尿酸氧化酶粗酶提取一.实验目的学

6、习可溶性表达蛋白质的初步分离纯化二.实验原理细菌工程菌胞表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体。另外一种是间质的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只 要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的 过程。蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜 的程度，以及蛋白质分子

7、带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变， 蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。三.实验用品1器材：超声破碎仪，离心机2 试剂：超声缓冲液：0.1 mol/L, pH 8.5 Tris-Gly （6.057g Tris , 8.0449gGly , 定容至500ml,定容前调 pH至8.5。）四.实验方法发酵菌液4000 rpmx25 min离心，收集湿菌体，每 1 g菌体加入15 ml 超声缓冲液。超声机粉碎破壁，功率

8、 300 w,工作时间5 s,间隔时间5 s, 共90个循环。取悬于超声缓冲液的菌体，10000 gX10 min离心，上清加（NH4）2SO4至40%浓度，静置1 h, 12000 gM5 min离心，沉淀用3 ml 0.1 mol/L的pH 8.4 Tris-Gly 悬溶；上清加（NH4）2SO4 至 70%浓度，静置 1h, 12000 g 15 min 离心，沉淀保留。五.实验结果1 .量得发酵菌液体积2 .量得发酵所得湿菌体重量3 .超声破碎离心后测上清 OD280,体积及留样1ml实验二尿酸氧化酶柱纯化一.实验目的学习根据蛋白质所带电荷，选择离子交换树脂进行蛋白质的分离纯化。二.实

9、验原理离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的 pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质， 所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。Sepharose是表示以琼脂糖为基质的胶， Sepharose Fast Flow分

10、的DEA E, CM, Q, SP就是在Sepharose分别偶联上 二乙基氨乙基，竣甲基， 三甲胺基，磺丙基，作为弱阴，弱阳，强阴，强阳四种离子交换填料。二.实验用品1 .器材：填料：DEAE-Sepharose F.F.;核酸蛋白仪；紫外分光光度计；梯度混合仪;分步收集器2 .试剂：透析液：20 mmol/L , pH8.5的硼酸盐缓冲液，即 2.5747 g硼砂与2.0407 g 硼酸溶于3000 ml蒸储水。平衡液：20 mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5。离子交换洗脱液：0.5 mol/L NaCl , 20 mmol/L硼酸盐缓冲液；2 mol/L NaCl , 20 mmol/

11、L硼酸盐缓冲液（pH均为8.5）。三.实验方法将硫酸镂纯化后沉淀用20ml, pH8.5, 20 mmol/L硼酸盐缓冲溶解，并透析过夜。透析后测量体积，测 OD280及留样1ml。配制20 mmol/L硼酸盐缓冲液500 ml,分别调节其 pH为8.5。采用上 述溶液平衡层析柱，上样后以 00.5 mol/LNaCl , 20 mmol/L硼酸盐溶液进 行梯度洗脱，再以 2 mol/L NaCl进行柱再生，流速2 ml/min ,收集尿酸酶活 力峰。四.实验结果1 .记录透析后体积，OD2802 .测收集的尿酸酶活力峰的紫外吸收值，并绘制尿酸酶的洗脱曲线。实验三尿酸氧化酶的鉴定一.实验目的学

12、习通过SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量及纯度二.实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N, N'亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

13、因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDSPAGE）。由于SDS-PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS-PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。三.实验用品聚丙烯酰胺储液：29 g丙稀酰胺，1 g甲叉双丙烯酰胺溶于 80 ml蒸储水，定容至100 ml。Tris缓冲溶液（1 mmol/L ,pH6.8,

14、积层胶）：于800 ml水中溶解121.1 gTris碱，用浓HCl调pH至6.8,最后加水定容至 1 L。Tris缓冲溶液（1.5 mmol/L , pH8.8,分离胶）:于800ml水中溶解181.7gTris碱，用浓HCl调pH至8.8,最后加水定容至 1 L。5 <ris-甘氨酸电泳缓冲液：在 900 ml蒸储水中溶解15.1 gTris和94 g甘氨酸，然后加入 50 ml 10% （m/v）电泳级SDS的贮存液，用去离子水补 至 1000 ml。6 样缓冲液：7 ml 4 Tris-HCl （pH6.8 , 0.28 mol/L） , 3.0 ml 甘油，1 gSDS, 0.

15、93 gDTT （或两倍摩尔浓度的疏基乙醇），1.2 mg澳酚蓝。考马斯亮蓝染色液：90 ml的甲醇：水（1:1 , V/V ）和10 ml冰乙酸混合液中溶解0.25 g考马斯亮蓝 R250,过滤。脱色液：45 ml甲醇、45 ml水和10 ml冰乙酸。四.实验方法取待测样液适量，加入 6X上样缓冲液，混匀，沸水浴加热 5 min,用于 上样。分离胶浓度为 12%,浓缩胶浓度为5%,电压80 V,电泳完毕后，剥 胶，考马斯亮蓝 R250染色，脱色至本底透明后摄片。五.实验结果根据电泳结果判断尿酸酶亚基分子质量及纯度。实验四尿酸氧化酶的活力测定一.实验目的通过尿酸氧化酶活力测定方法的学习，了解一

16、类酶的活力测定方法。二.实验原理酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。酶活力的大小常以每 mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）mol数表示之。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用

17、测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP,如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶； 或者反应产生 H2O2,如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之，测定酶活性的方法很多， 应根据具体情况选择合适的方法。三.实验用品底物液：0.001%尿酸（缓冲体系为 0.1 mol/L , pH8.5硼酸缓冲液）四.实验方法酶活测定反应体系均为0.1 mol/L, pH 8.5硼酸缓冲液，以0.001%尿酸为底物，25 C反应5 min,每隔30 s测一次293 nm处吸光值。酶活单位定义为每分钟催化1科mo底物转化为产物所需的酶量。五.实验结

18、果绘制尿酸酶各步骤纯化后的活力回收表。实验五尿酸氧化酶性质研究一.实验目的对尿酸酶的主要性质进行研究，探讨影响尿酸酶活力的各种因素及尿酸酶的最佳保存条件。二.实验原理酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions ）:酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。1 .底物浓度对反应速度的影响：底物对酶促反应的饱和现象：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应

19、速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后， 随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最 后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底 物浓度的增加而增加(零级反应)。米氏方程及米氏常数：根据上述实验结果，Michaelis & Menten于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程：vVmaxS/(Km+S)。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数。Km和Vmax的意义：当丫 =Vmax/2时，Km=S。因此，Km等于酶促反应速度达最大 值一半时的底物浓度。当k-1>>k+2 时，Km=k-1/k+1=Ks

20、。因此， Km 可以反映酶与底 物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。Km可用于判断反应级数：当 S<0.01Km 时，丫 = ( Vmax/Km )S,反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比；当S>100Km时，V =Vmax,反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当 0.01Km<S<100Km 时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合 级反应。Km是酶的特征性常数： 在一定条件下， 某种酶的 Km值是恒定 的，因而可以通过测定不同酶(特别是一组同工酶)的Km值，来判断是否为不同的酶。Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同

21、的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当S=10Km 时,丫 =91%Vmax,为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间每个酶分子催化底物转变为产 物的分子数。Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk 双倒数作图法和Hanes作图法。2 .酶浓度对反应速度的影响：当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即v=kE。3 .温度对反应速度的影响：一般来说，酶促反应速度随温度的增 高而加快，但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用， 反应速度迅速下降。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温 度就称为酶的最适温度。酶的最适温度与实验条件有关，因而它不是 酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但 温度升高后，酶活性又可恢复。4 . pH对反应速度的影响：观察 pH对酶促反应速度的影响，通 常为一钟形曲线，即pH过高或过低均可导致酶