定量PCR中ct值的含义

1、实时荧光定量PCR实时荧光定量 PC限术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCRM定性到定量的飞跃，而且与常规PCRffi比，它具有特异性更强、有效解决 PCR亏染问题、自动化程度高等特点，目前已得 到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一.实时荧光定量PCRM理所谓实时荧光定量PC做术，是指在PC皈应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR4程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。1. Ct值的定义在荧光定量 PC做术中，有一个很重要的概念一一Ct值。C代表Cycle , t代表thresho

2、ld , Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设 定的域值时所经历的循环数（M图1所示）。图1. Ct值的确定2. 荧光域值（threshold ）的设定PCRS应白前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcy.e 53. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲

3、线上计算出该样品的起始拷贝数。图2.荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PC所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料 现将其原理简述如下：1） TaqMan荧光探针：PCRT增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一 寡核甘酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整 时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCFT增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从 而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA连，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCRT物形成完全同步。如图 3所示。图3. TaqMan

4、荧光探针工作原理2） SYB浅光染料：在PCRS应体系中，加入过量 SYB戕光染料，SYB戏光染料特异性地掺入 DNA链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYB磔料分子不会发射任何荧 光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCRT物的增加完全同步。二.内标在传统定量中的意义1 .几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR&应管中加入已定量的内标和引物， 内标用基因工程方法合成。 上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增o 在PCRT物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或 高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板 2

5、）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应 管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标 记）。扩增后用内切酶消化 PCRT物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段， 而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧 光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3） PCfR- ELISA 法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合， 再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR- ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线， 也可实现定量检测目的。

6、2.内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR达平台期后进行检测，而PC性过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PC碗上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图 4）,因此无法直 接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所 造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略 定量的方法。图4.相同模板在同一台PCFa上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性三.内标对荧光定量 PCR的影响 1.实时荧光定量PC就需内标实时荧光定量PC做术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实 现了

7、每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过 对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定 量PC就需内标是建立在两个基础之上的：1） Ct值的重现性PCR1环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期）， 此时微小误差尚未放大，因此 Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩 增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）2） Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进 行定量测定，因此，实时荧光定量 PC谭一种采用外标准曲线定量的方法。3） 内标对实时荧光定量 PCR勺影响

8、若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCRS应变为双重PCR双重PCRS应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著17,8二但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也 正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法 学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外 标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方oApplied Biosystems 公司的7700型实时荧光定量 PCRCZ是全球

9、公 认的荧光定量PC郎勺金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采 用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PC谭迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转 基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域110,11,12,13:参考文献1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026

10、-1030.2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems3. 定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用.中华检验医学杂志2000,23(2): 120-121.4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reactio

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16、threshold)的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第315个循环荧光信号标准差的 10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线T关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩