G418筛选稳定表达细胞系经验总结

1、G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有 其他战友遇到的情况，和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。筛选之前确定G418浓度：1、 山于每种细胞对G418的敬感性不同， 而且不同的丿家生产的G418有效成分 的比重不同，一般lg的粉剂中有效的G418含量大约为0.722go2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而 杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋口能够分解新霉素G418o在 进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可

2、能对细胞产生较大影响，加上G418有杀 菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。3、 汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4、G418的活性不尽相同， 所以在筛选之前， 一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml,在lOOug/ml-lmg/ml的G418浓度 范围内进行筛选，选择出在10-14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进 行下一步的筛选试验。6个细胞电转后，分别接种1/4000. 1/1000, 1/300细 胞到一个具体试验：3x1024孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大 约50%汇合度。理论上

3、1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有儿十个克隆，事实上，它们儿乎 全死光了，只有儿个克隆。加药时间和维持浓度1,山于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太 早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时 间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一 般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和 活性都会下降，所以每35天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度 可以降至200ug/mlo2,加抗生素的时机，主要是考虑

4、插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表 达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般 是筛选浓度的。1/2.关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且, 如果你要挑选到儿个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。 当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。筛选时的培养液加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无儿。这时会岀 现两个问题：1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡， 即非选择性死亡，因此要及时换液2,孔中细胞数LI很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的

5、状态 不佳其至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器 消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种 培养基。3,适当增加血清浓度。筛选时出现的问题及其解决办法：问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一 些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩 散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近）， 就是说儿个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？a、可以减少胰酶量；胰酶在加入

6、之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞 层，以减少可能残存的血清的影响；b、加入胰酶后，稍过儿秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN,这时，消化酶可以继续作用的，乂可避免胰酶扩散;c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走 你的可隆了呀d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完 全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。我的建议：1、在100mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化 下来，在96孔板中逐步稀释获得单克隆2,问题2。筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的

7、机率还是比较大 的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70-80%,但是想挑到表达量高 且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘 故。3,问题3。细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态 的改变。想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象 还有好儿种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。4,问题4。单克隆化的时机和个数：加药筛选时，一般等到确认的转染细胞长到70%以上时，再做有限稀释法，以克隆出阳性细胞，同时要保持适当的药物浓度， 以防突变和污染。若细胞长好了，如有40%以上，就可以有限稀释了一般，筛选5, 6

8、个克隆就有需要的克隆，但保险起见，筛10个吧。5,从单克隆化时开始，就要加大营养，清和生长因子。单克隆化的操作方法；1方法lo单克隆细胞的培养就是这样的， 我现在作了15个96孔板的单克隆， 总 共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个， 因此， 我一般 在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以山满 意的结果你所说的现象我也遇到过，我也白思不得其解，只好做多一点的96孔板 来补充。培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP,然后进行了G418抗性筛 选和96孔板单克隆筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有 所帮助。2方法2。实验

9、步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎 牛血清的细胞培养液，0.1ml/孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定 表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞 液接种于96孔板的第一排，0.2ml/孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排， 混合后，从第一排中吸取0.1ml接种于第三排，一直到第八排，最后一排都 丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中只有1-2个细胞。3方法3。我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔， 然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里

10、用灭过菌 底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共 获得了6株单克隆。但需注意的是：时间不能超过30min,否则细胞极容易死亡。 解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练 习，我练了56次后非常熟练了培养液：最好是含15%的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方 法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作 为单克隆的培养液。4方法铁 我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照 射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑儿个， 然后在96孔板内先加好培养基，再

11、将6孔板内的培养基吸岀，加入少量的胰酶， 大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大 的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了， 动作快一些时能吸十儿个克隆，我做过儿次了效果很好，没有出现污染。（在要 进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有 什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。5方法5。关于稳转的方法，好像园子里很多xdjm都用的是有限稀释法来作， 但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都 是这

12、样：lo 3.5cm 1IIL铺细胞，长到大概80%以上的时候作转染。2。转染后一天消化，传到一个大皿（4 6）或者两个大皿（1：12）。3。再过一天后加入带G418的培养基。4。依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量 死亡，活下来的细胞就形成单克隆。5。单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200U1枪挑取细胞集落，一般 挑上48个，种在两块24孔板上。6。于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。我们基本上都是这样pick stable的， 除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apopt

13、osis的inducer之类的基因比较难挑到stable夕卜，一般还都能挑到stable。当然，转染效率不能太低，超过50%就相对比较容易了，10%以上的可能最后 形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。对于那些转染效率很低的细胞，我会 连续转染三次（中间如果细胞长满了就传代），好像比较有效。除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法 来作，要不好像也太麻烦了吧？耗时也多单克隆化后细胞特点和处理：1单克隆后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查 文献确认一下。2单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出 现传代后细胞浮起

14、来后死亡的现象。3筛选成单克隆后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死 亡细胞则可以认为是稳定细胞系。复苏后加G418传代2次，然后按部就班。4过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药 后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。5稳转PA317细胞后再次筛选（需要隔一段时间再加压筛一次），细胞也是死的 厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。可以在细胞传儿代后，分出 一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度 培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。6有人这样做

15、的：转染加药一段时间后，板子上出现了儿个克隆，如果有儿十个 克隆，然后挑其中七八个克隆到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转 到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定LI的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保 留下来，阴性的丢掉。单克隆化后鉴定：1稳定转染细胞， 通过PCR鉴定， 发现U的基因并不上调， 瞬时转染表达是增高 的。原因：瞬转是在强启动子下，稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子，或 者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下！2转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你 想要蛋白的

16、单克隆可以认为是整合了质粒的。G418筛选稳定表达细胞系1.G418的配制:方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液， 浓度为1 OOmg/mb完全溶解后，0.22um过滤，-20C保存。方案二:（1）配制1MHEPES：23.8gHEPES（缓冲能力更强） 粉末溶于100ml ddH2O,lONNaOH（加量较多）调节pH至7.3,过滤除菌（较难过滤），4C保 存，终浓度为lmol/Lo（2）5gG418溶于10ml IM HEPES （pH7.3）,终浓度为500mg/mb -20C保存。注：实验中采用方案二时效果较好。2制备筛选培养基:用培养基将G418稀释为0 ug/ml、20

17、0ug/ml、300ug/ml、400ug/mR500ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml s800 ug/mR900ug/mR1000ug/mlHOOug/mk 1200ug/ml24孔板，每孔lml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml,现用现配。400 ug/ml800 ug/ml 1200ug/ml500 ug/ml900 ug/ml1000200 ug/ml600ug/mlug/ml300 ug/ml700 ug/ml 1100ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996.8996995.2994.4993.699

18、2.8992991.2990.4G418(500mg/ml1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3细胞培养：将冻存的细胞复苏培养传代3至4次使细胞达到良好的生长状 态，铺24孔板（20000/JL）, 12h换液，加筛选培养基培养。4确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入 不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10J4天，以最低细胞全 部死亡浓度为基准。注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/mL5铺6孔板（20万/孔），第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。转染24小 时

19、后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。注意：细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果（G418很难发挥作用）。时，吸出所有培养液，离心6在换液一两次后（换液后培养过夜），细胞达50%-80%C4倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，加入2混匀3000-4000rpm,吸 上清022um过滤，备用。中所配制。或者可以增6培养天左右细胞大量死亡 时，可以换用适应性培养基，即67血清，此时则可以采用20%血清。加血清 浓度培养，例如原来用10% G418浓度减半，维持筛选圧力。8培养10天后将 天 后可见有抗性克隆出现。9筛选约14套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性 克隆，高倍镜下标记阳性克隆,10.挑单克隆：

20、将其转入多孔板培养。消化，把 消化液吸到另外一套环法：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA个 新的培养孔中培养。刮除法：刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。检测LI的基因的表达，RT-PCR单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总ll.RNA western检测目的基因。抗注意：转染时压系时细胞不能铺的太满，不然肖细胞连接紧密后，压系时不具G418性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。G418筛选稳定表达细胞系总结一题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培 养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能 此时加抗生素

21、均是氨基糖貳类药物，其药理作用完对细胞损伤较大。因为庆大霉 素、链霉素、G418全一样。所以没有必要再用，而且山于另外抗生素的添加实 际增加氨基糖貳类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实 际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前 的观点了，而且只是少数人的观点。我两种方法都用过，但没有特异的比较过, 感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精确到小从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。位。脂质体是现在主流的转染试剂, 数点后2Qiagen非脂质体是这儿年发

22、展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小, 价格也不贵，就有一个系列。我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验 室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始, 购买之前先下载个说明书看看。有精力就比较一下儿种方法，一般的用达到LJ的就行了。关键是实验设计。和筛选G418筛选之前的活性G418 III于每种细 胞对G418的敬感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀G418不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定浓度范围内 进行筛选，选择出G418100ug/mL-lmg/mL的释到1000个细胞/mL,在G418浓度来进行下一步的筛选试验。

23、天内使细胞全部死亡的最低在10-14范圉。而 且1000ug/ml山于每种细胞对G418的敬感性不同，一般变动在100ug/ml的 活性不尽相同，所以在筛选之询，一定要确定你不同的厂家生产的相同浓度的G418的最佳用G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系的细胞对 这一批G418的最佳用量。量还是稳定的。分子克隆给出了儿个常用细胞系 所需G418 ug/m 1浓度（）细胞系或机体G418800 700中国仓鼠卵巢细胞细犬肾Madin-Darby500胞细胞人上皮A431400细胞猿CV-150035盘基网柄菌属10植物10500酵1256细胞到，101/300个细胞电转后，分别接种1

24、/4000, 1/1000看下面的 一个试验：3X1/400050%汇合度。理论上细胞孔内大约孔板中，48h后加药筛 选，此时1/300241/3001/4000孔内有两三个克隆，按比例孔内应有4%的汇合 度。筛选9天后，观察孔内应该有儿十个克隆，事实上，它们儿乎全死光了，只 有儿个克隆。所以汇合度对50%筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜 超过！G418加药时间山于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋口质。 所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大， 增值较慢，时间长了就会被没有小时之后外源基因转入的细胞所淹没，最终导致 筛选不出阳性克隆，一般要在转

25、染24天都的浓度和活性都回下降，所以每3-5G418筛选。随着细胞的代谢G418才开始加。G418的筛选液。这时药物浓 度可以降至200ug/ml要更换一次含有 培养液天左右，细胞会大量死亡，孔中 只剩下的细胞寥寥无儿。这时会出现两个6加药筛选约表达的阳性细胞死亡，即neol死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有问题：孔中细胞数LI很少， 细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞非选择性死亡。2细胞，在的状 态不佳其至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3的时候， 换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和80%细胞汇合度达到3T3混 合备用。再转染后筛选过程中就可以

26、应用这种培养基。：11新鲜的培养液按挑 选单克隆的优化可为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以 及增加阳性克隆的得率，以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。 加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔 做个标记。然后刮除隐性克隆，消化消EDTA阳性克隆后继续筛选培养；或则用 套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或孔板96化，把消化液吸到巧外一个 新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在中筛选。鉴定之后但是外源基因如果没有整合到得到的阳性克隆都比较稳定。一般经过4周左右的筛选，基因组中的话，LI的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整 合到

27、基因组中的概率太小随着培养时间的延续，会导致表达的LI的蛋白的量产生 很大差异。了，而且是随机整合，强表达LI的蛋口的那些丢失了外源基因的细胞 和很少表达LI的基因的细胞会占据优势，次以上的筛选之后才能找到细胞会越来 越少。2这样再次筛选是必不可少的。只有经过 那种我们想要的强分泌U的蛋 白的，遗传稳定的细胞克隆。最全的2 () G418筛选稳定表达细胞系总结！Protocal,过滤消溶于1.G418的配制： 取lgG4181ml lMlOml的HEPES液中， 加蒸憎 水至 毒，4度保存。6细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接 种入多孔培养板中，培养2.小时左右开始加药。范围内

28、确定儿个梯度，比如先 做个1000ug/ml3.制备筛选培养基：在100ug/ml制成G418100ug/ml、400ug/mK800ug/mll000ug/ml,按梯度浓应用培养基稀释筛选培养基。每孔 中加入不同浓度的筛选培养洗涤一次，4加G418筛选：吸除培养孔中培养基，PBS基。每5换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，35天更换一次筛 选培养基。方法同4浓度即为最佳G4186.确定最佳筛选浓度：在筛选1014天内能够杀死所有细胞的最小浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情G418筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418况：用某一浓度G418的量在筛 选14天后还不能杀死细胞，而用下一个

29、梯度的在第800ug/ml天前就看不到活 细胞了。10假如是400ug/ml不能杀死细胞，而的量在进一步筛选，、则可以再 用500ug/ml 700ug/ml600ug/ml5天就把所有细胞都杀死了，的最佳用量还是 比较稳定的，G418以确定最佳筛选浓度！心得：山于特性明确的细胞系，现在 我所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞。 这时的敬感性，我用的筛选浓度是200 ug/mlG418告诉你我测试过NIH3T3细 胞对 三个浓度进行筛选。300ug/ml、你就可以做150ug/ml200ug/ml通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。密度传代，继

30、续a转染：转染后培养2441：小时或者更长，到细胞增长接近汇 合时按培养，待细胞密度增至50%汇合时；70筛选培养基。G418去掉培 养液,G418:PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的b加当有大量35换液： 根据培养基的颜色和细胞生长情况，每天更换一次筛选培养基。c天后，可见有抗性的克隆1014筛选细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持 筛选。岀现，停药培养，待其逐渐增大后；孔板中。在96个d挑单克隆：制备细胞 悬液，细胞讣数， 用培养基稀释细胞到1/lOul待其逐渐增大后转入到孔， 加入 培养基150U1/再加入细胞悬液10ul/?Lo 48孔中增殖。e单克隆鉴定： 细胞大 量扩增后，

31、 提取总RNA检测H的基因是否存在做RT-PCR常见问题：1转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？无怪乎两种形式: 整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是 存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只 有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。 基因和U的基因是不是一 定会整合在一起？2neo基因表达而LI的基因不一定都表达，所以在筛选neo整 合是随机发生的非同源性重组，的方法进一步鉴定。之后还要用RT-PCR培养 基处理的个人技巧体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程, 期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培

32、养液中摄取营养的同时， 也向培养 液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这 个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数I 多比数LI少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会 受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培 养基的同化作用不强，也不 利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的：适应性培养基的配制a培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养2448小时后， 吸出所有培养液b离心：30004000rpm 10 min后，吸取上清液倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。滤器过滤，再加入2c虑过：再经直

33、径0.22umeeflying加入， 每孔lOOuLl. G418筛选要做预试验确定最佳浓度， 将细胞稀释至1000cell/mL,500300, 400浓度稀释至0, 100, 200, G418有培养基的24孔板,将每孔中的天,以最低细胞10-14等12个级别。培养，900, 1000, U00ng/mL700600, 800维持使用筛左右，筛选时比该浓度再高一个级别，全 部死亡浓度为基准，一般400-800选浓度的一半。代以后用维持量，但不能不 用，因为有时候抗性基因会丢失，10.我们掌握是传过2G418.很快会形成优势的。如果没有G418抗性，也不一定有的基因，单克隆化操作是很重要的。

34、.3即是有LI的蛋白表达有的多，转染后，每个细胞内L1的基因与宿主染色体的整 合状况是不同的，在生长若干代之后，外源蛋口表达少的细胞山于代谢负荷较小， 所以生长较快，有的少，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞 会山于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋口基因后，表达越来越暗就是这个道理。 所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量 一致，也是对高表达细胞的保护。左右就可以进行该操作了，大多数冻存，留200cell操作用96孔板法，每代细 胞长满后，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。这点 外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，

35、1.可以肯定的 是，立体结构都验证过，表达量与整合数LE上游序列特性，特定部位DNA我 们做过FISH但并不能掩盖其它因素对表达的影响oSV40只是增加了表达了数山 是相关的，装入了基因也是这样，neo的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。GFP按你的讲法，转染完而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细 胞同一基因的数LI也不会相同，表达了，但U的基因丢失了的情这点可以用数学 关于泊松分布的观点理解。有时，neo况也是有的。某一细胞内随机含有一定 那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，2.的可能性，及所有拷贝均为另一种基数LI拷贝数外源基因，那么，一种基因拷贝 数为0*.

36、个因的概率就很小， 很大的概率为外源基因的不均质。 打个比方， 一个大口袋，抓100然后以从中抓若干个， 这些球均为红球的概率有多大呢？应该个黄球，红球， 再抓100,实际上是筛选的外源neo是很小的。红球就是neo,黄球就是 你的LI的基因。我们用个红球，另一次抓着5基因整合的数口，怎么说呢？用刚 才的例子来说，如果我们抓着个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第 二次黄球数LI比第一次多的概率10就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。 但不能没有。或者隔一定时间从维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低 些，3.祈使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维

37、 一下，实际上我们在筛选耐药株呀。酶来支持，否则细胞也要被毒neoG418浓 度就要有更多的4. neo的产物是酶，过高的死的，而此时过多的酶要求会对细胞 代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与液中生长速度也不G418增殖， 我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的同，严重形态也不同。这 就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理 解吧。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，山儿代之后，不 受影5.响的细胞会占优势的。仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理, 实在是个人经验，而且在基础 科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人 士的理解和

38、经验。96孔板单克隆操作了在第10天左右就手挑单克隆或者本帖 开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓 度的一半。 筛选稳定表达细胞系总结三G418也许是我们实验室的翻译，实 际上就是指细胞占培养表面的比例，（confluence）汇合度100%。汇合，也就是 汇合度如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%6和1/4000X10细胞 电转后，我把电激杯中的细胞分别接种最近的一个实验是：3细胞l/300g418孔板中，48小时后加筛选，这个时候接种了241/3001/1000和到左右汇合，今 天是筛选细胞的孔会汇合，而理论上接种了的孔会大约50%1/40004

39、%:个克隆，但孔会有2030天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300后第9实际的情况是它们儿乎全部死光了，仅有少数存活细胞！g418筛选影 响很大，这耽误了我将一个多月。所以我认为汇合度对筛选时间太长，到后来一 般会对细同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418jiangql胞生长有影响。以下是一些建议，供参考：首先需要扩增细胞，冻存部分中间 产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就 会全军覆没。就可以减半 维持。7天后G418一般5 勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。20%,质量要好。血清浓度可以高到 进行真核转染的一般程序：准备真核表达 载体一将H的基因插入

40、表达载体中一转染一克隆U的基因（经测序验证）一筛 选一鉴定 为LI的基因，介绍真核转染的实验操作。为载体，pl6下面以pcDNA3试剂准备一、调1M Hepes,90ml ddH溶于0,加入、1 HBS （Hepes-buffered saline ）：876mgNaCh，滤过除菌。至100ml pH7.47.4,pH到补ddHO22.核酸贮存液,过滤除 菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二.操作 步骤（一）克隆LI的基因端分别-检索的口的基因序列，设讣扩增引物，并在上、 下游引物的5、根据IGenBank oXho I，行RT-PCR I和引入酶切位点BamHT2回

41、收特异性扩增片段，连入载体。 ,质粒制备。3、转化DH5、酶切初步鉴定，测序证实。4真核重组表达载 体的构建：（二）载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗PCDNA3序列所必需的所有真核表达组件。性基因，以及表达外源DNA丨双酶 切BamH I和XhoM组质粒与pcDNA3分别用 线性片段回收插入片段和pcDNA3连接酶连接T4 a转化DH5质粒制备 【双酶切鉴定。 和XhoBamH细胞： 转 染SHG-44（三）重组pcDNA3、分别用100mg/L培养于24孔培养板一G418 SHG-44 1、G418筛选浓度测定：复孔，设正常加入，各浓度3、500mg/L、

42、600mg/L200mg/L. 300mg/L、400mg/L 200mg/Lo复孔。以10-14天细胞全 部死亡的浓度为筛选浓度，结果为对照3各种细胞的平板密度依据各种细胞的生 长率和细胞形状在转染实验前天接种细胞，2、)，每35mm覆盖。一般要求，6孔培养皿(而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%s 10细胞。依据不同大小 培养板调整每平方厘米的细胞数量。孔l-2ml培养基3X典型贴壁细胞平板 密度)培养基容积(ml培养板大小 生长面积(cm大约细胞数)5-6 s 60mml0)组织培养皿(4)X6. 6 28)3X106孔培养板(35mm 9.5 1-2 s . 0 X. 1)孔培养

43、板1222.6mm310 5-1 4s5125孔培养板(28m5s细胞的转染：3、SHG-44新鲜的有血清或/DNA混合 物之前的短时间内，更换lml(l)转染当天，加入脂质体 无血清培养基溶 液A准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。 )o u g/ml50 u 1 (30DNA (pcDNA3、重组pcDNA3) 1.5 u g至lj总体积用HBS稀释，B.混合溶液A和u脂质体到终容积501 (120 ng/ml)用溶液B：HBS稀释6 u 1/DNA混合物形成。轻柔混合(不要振荡)，室温孵育15min,以 便脂质体，混合物(从培养孔一边到另一边)1脂质体

44、/DNA不要移去培养基，逐滴加入100 u边加边轻摇培养板。37C孵育6hr(4)新鲜生长培养基。6hr后更换转染培养基，加入2-3ml(5)的培养基培养。24hr后施加筛选压力，改用含0418(6)转染天后，挑出单 克隆，扩大培养， 同时14G418筛选浓度下持续培养4、G418筛选:在SHG-44。SHG-44-vect转染pcDNA3即,并设对照组细胞即四G418筛选稳定表达细胞 系总结(一)筛选结果鉴定：鉴定外源基因提取一)基因组DNAPCR (1裂解 -聚丙烯酰胺凝胶电泳一免疫SHG-44-vectpcDNA3阳性细胞、重组(2)SHG-44- Western-blot蛋白表达()。

45、印迹鉴定P16SHG-44细胞增殖的影响(3)测定外 源性基因对70%pcDNA3重组一单细胞悬液-SHG-44-vect流式细胞仪分析：SHG44、SHG-44-期S、/M期和G酒精固定一裂解细胞一核糖核酸酶消化一碘 化丙唳染色一上机分析G21比例。孔接种/410组pcDNA3-5X细胞生长曲线测定：SHG-44. SHG-44-vect. SHG-44-后各自用苔盼蓝染色讣数细胞一讣算细胞主长抑制白分率。孔培养板一24hr244细胞一10SHG-44重组pcDNA3-SHG-44-vect软琼脂克隆形成率分析:SHG-44、个细胞的克隆数一计算克隆形成率周后计数不可少于500.3%低熔点

46、琼脂糖培养-1-2抑制率。三.注意事项混合孵育密度、细胞密度、脂质体和DNA优化转染条件(脂质体的用量、DNA1、时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污 染,所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。 但是，脂质/DNA混合物无需滤过除菌。体以及脂质体与被/DNA预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体2、转染细胞共孵育的过程中，血清乂是培养基的一部分。C预温。在转染之前更 换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须373.混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，/DNA脂质 体4、边加入边轻摇培

47、养川L,以确保均匀分布和避免局部高浓度。常见问题和解答：96孔办法效率高。Q：我觉得套环法操作不如96用如果克 隆效率较低的细胞，套环可能更好：也不一定A依据实验U的与要求而定. 即使是增加到每孔十儿个细胞或上如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆 孔板法，万个细胞个板）0010个96孔板也只能培养一万个细胞，十万个细胞就 至少需要白个，且细胞在单独生长条对于转基因细胞筛选或基因打靶丄作量就 太大了就需要100个板有因此还得看这位朋友使用的是什么细胞”件下,远远不 如千万个细胞共同培养活力好需要的单细胞克隆株数筛选还是不筛选”转基因还 是非转基因限细胞系还是无限细胞系,？量多少筛抗性基因的质

48、粒后，如何用G418Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo儿篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞50选？我查 看了国内、外其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果 稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的 剂量、维持剂量以及筛选持 续时间乂该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂 量是否有一定关系？加100U1筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml,每孔A：1.G4180,100, 200,300, 400,500, 600,700,浓度稀释至将 每孔中的G418入有培养基的24孔板，以最低细胞全部死亡浓

49、度为基天，培养10-14800,900,1000J100ng/ml等12个级别8 0 0左右， 筛选时比该浓度再高一个级别， 维持使用筛选浓度的一半。 准, 一般400代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，2。我 们掌握是传过10,很快会形成优势的。如果没有G418G418抗性，也不一定 有目的基因，单克隆化操作是很重要的。3。即是有:请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与LI的基因表达的关系吗？Q：转染后，每个细胞内LI的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，I的蛋口表达 有A的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞山于代谢负荷较小，所以生长较快， 在生长若干表达最弱的细胞会山于竞

50、争优势占主要，长期之后，代之后，表达少 的细胞会形成优势，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以， 要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致也 是对高表达细胞的保护。操作用左右就可以进行该操作了，该孔板法，每代细胞 长满后，大多数冻存，留2 0 096cell方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培 养书中均有讲述，我就不赘述了。必须指出，单克隆化要做儿遍，一遍是不够的， 我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。现在 很多代了，很稳定。基因，好像就不存在外源蛋口表达少的细胞形与neoSV40Q：1。我的质粒中含有成优势这个问题了吧（弋

51、，筛选要进行。2按您的讲法，10那么维 持剂量要进行多长时间？如果我使用对照组在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗？对G4183o在细胞用胰 酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在 细胞是否有影响? 对之都无影响？从理论上讲是否无论多大浓度的G4184o既然细胞表达neo,可以 肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，1A：立体结验证过，表达量与整合数LE上游序列特性，特定部位FISHDNA这点我 们做过只是增加了表达了数LI,但并不能掩盖其它因素对表达的构都是相关的， 装入了SV40基因也的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo影响。按

52、你 的讲法，转染完GFP是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同， 不同细胞同一基因的数LI也不表达了，但LI的基因丢会相同，这点可以用数学关 于泊松分布的观点理解。有时，neo失了的情况也是有的。2。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机 含有一的可能性，及所有拷贝均为另0定数口拷贝数外源基因基因，那么，一种 基因拷贝数为一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比 方，一个大口袋，抓这些球均为红球的概率有多大个黄球，然后以从中抓若干个，1 0 0个红球，再抓100,实际上是筛neoneo,黃球就是你的LI的基因。我们 用呢？应该是很小的。红

53、球就是选的外源基因整合的数Lh怎么说呢？用刚才的 例子来说，如果我们抓着5个红球，列一次抓着1 0个红球，可以肯定，的二次 抓的球比较多，那么第二次黃球数H比第一次多的概率就很大了。因为二者出 现的概率比是恒定的。3。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间反向思维一下，我不知你是否干临床，想想抗生素 的用药原则，从新使用筛选量压一下，实际上我们在筛选耐药株呀。酶来支持， 否则细胞也要4 1 8浓度就要有更多的Gneo 4oneo的产物是酶，过高的被毒 死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成 分液中生长速度G418裂与增殖，我们曾

54、试过，即使在同一转染阳性细胞，在不 同浓度的也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数 论的，用米氏方程理解吧。5。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，山儿代之后， 不受 影响的细胞会占优势的。仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟岀的道理，实在是个人经验，而且 在基础科学领域顶多算票友， 我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。Another answer:外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录 染色1质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为 了获得高表达的复制起始位点，包含SV40细胞株，需要对

55、重组克隆进行筛选。 某些载体如pcDNA3有利于提高质粒的随抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达, 可以是质粒在反式提供大T机整合儿率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因 表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致L的基因 的损坏甚至丢失。2。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗 性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。PROTOCOLG418筛选稳定表达细胞系，过滤消10ml的HEPES液中，加蒸镭水至1.G418的配制：取lgG418溶于1ml 1M度保存。毒，46细胞培养：取待测培养细胞， 制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，

56、培养2.小时左右开始加药。范 围内确定儿个梯度，比如先做个lOOOug/mllOOug/ml3.制备筛选培养基：在 制成，按梯度浓度用培养基稀释1000ug/mlG418400ug/mK 800ug/mK lOOug/ml.筛选培养基。 每孔中加入不同浓度的筛选培养PBS洗涤一次，G418筛选：吸除培养孔中培养基，4加 基。 。天更换一次筛选培养基。 方法同45.换液： 根据培养基的颜色和细胞生长情况， 每35浓度即为最佳天内能够杀死 所有细胞的最小14G4186.确定最佳筛选浓度：在筛选10浓度的可能性不大, 最有可能的是出现这种情筛选浓度。在笫一轮就筛选出最佳G418G418的量在 筛选G

57、41814天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的况：用某一浓度在第而800ug/ml假如是的量在10天询就看不到活细胞了。400ug/ml不能杀死细胞, 进一步筛选，、则可以再用5天就把所有细胞都杀死了，500ug/ml600ug/ml700ug/mk以确定最佳筛选浓度！心得：山于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较 稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敬感性， 我用的筛选浓度 是200 ug/mlo这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml 300ug/ml三个浓度进 行筛选。通过预实验确定

58、了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。a转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传 代，继续培养，待细胞密度增至50%70%汇合时；b加G418法掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选 培养基。c换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选1014天后，可 见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；d挑单克隆：制备细胞悬液，细胞讣数，用培养基稀释细胞到1个/10uh在96孔板中加入培养基150ul/?L,再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖

59、。e单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA,做RT-PCR检测U的基因是否存 在。常见问题：1转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？无怪乎两种形式：整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转 染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出 这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起？整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而U的基因不一定都表达，所以 在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。培养基处理的个人技巧体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养

60、 液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代 谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞 同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数LI多比数LI少较易 生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的 影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的： 适应性培养基的配制小时后，吸出48培养同源细胞至半汇合状态时，更换一 次培养液，再继续培养a 24所有培养液4000rpm 10 min后，吸取上清液b离 心：3000倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。0