石蜡切片冰冻切片超薄切片

1、石蜡切片技术 虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等

2、。硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。第一节 组织制片的概述组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。组织制片技术随着生物学和医学的发展而发

3、展。切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。第二节 制片的种类一、 组织切片法：任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以m计），再进行染色而得到结果。在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。病理学研究中最常用的组织切片技术是常规石蜡切片和冷冻切片。其要点是将研究的组织进行切片，然后进行各种染色。冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片。二、组织非切片法不用

4、切片机，不经过切片手续而制成组织切片的方法，包括整体封藏法、浮片法、压碎法和组织直接印片法。这些方法操作简单而快，可根据制片的需要进行选择使用。第三节 石蜡切片技术石蜡切片法组织切片的主要程序： 一、取材 取材是根据实验目的及临床活检、尸解组织的病变程度而合理取得组织材料。为了制作优质的切片，取材时组织愈新鲜愈好，并应及时固定。（一）病理标本的来源及分类： 病理标本的来源有临床活检、尸体解剖、实验动物、培养细胞。主要病理标本大致可分类如下：1、手术标本 2、内镜取材标本3、穿刺取材标本4、细胞学标本 可分为：痰、尿、阴道分泌物、胸水腹水、穿刺细胞学标本、内镜刷取标本、其它等。（二）取材的一般原

5、则1、认真观察，取准标本病变部位，切勿漏取。 2、要能全面反映出器官有无病变，显示病变全貌(最大面积)，包括肿瘤转移部位、切缘等。 3、根据临床或肉眼所见及病史提示对病变组织多取材，主要病变与相关组织多取材，特殊病变要尽量多取材。 4、若取材大小受限，应尽量取包含病变周边相对正常组织。 5、应避免选取凝血块、坏死组织及粘液成分。 6、要全面描述病变状况，由表及里，测重量、部位、体积等。（三）取材方法 常见标本取材方法如下： 1、阑尾炎标本2、肿瘤标本3、胃标本4、肠标本5、肺、肾脏标本6、乳腺癌根治标本7、子宫标本8、卵巢与输卵管囊肿标本9、淋巴结标本10、一般小标本（四）取材注意事项1、新鲜

6、2、配合3、目的4、部位5、避免挤压6、大小7、数量8、方向9、标记10、手术11、小标本12、交叉污染 （五）临床病理取材注意事项 姓名、样本、件数二、组织固定（一）固定的作用：1、保持细胞与生活时的形态相似。2、保持细胞内特殊的成分转变成不溶性物质。3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，以便染色后易于区别和观察。4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。（二）原理：使组织及细胞内蛋白凝固；使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质。（三）方法：浸泡、灌注（局部灌注、全身灌注）、蒸汽熏蒸 （四）固定时间: 一般固定液在24小时内不能穿透厚度大于23mm的实体组织或0.5cm的多孔疏

7、松组织。常规组织病理学：可长时间固定细胞病理学：可长时间固定细胞化学：不宜过长，约1小时为宜（五）固定注意事项1. 固定液有毒性，注意自身防护2. 及时，尽可能新鲜。3. 超微结构观察：低温固定4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要5. 固定液用量：足，必要时及时更换。一般应为组织块总体积的45倍，也可达1520倍。（六）常用的固定液：1、单纯固定液：甲醛、乙醇、丙酮、戊二醛、醋酸、4%多聚甲醛2、混合固定液：乙醇-甲醛液（AF液）、B5固定液（醋酸钠-升汞-甲醛）、Bouin氏液、Carnay氏液、Zenker固定液、氯化汞、苦味酸、重铬酸钾、AAF液、甲醛-生理盐水等。三、固定后处理：

8、（一）固定后处理的目的：及时洗去固定液，有利于脱水、切片和染色，并防止染色中甲醛色素的产生。（二）固定后处理的注意事项：洗涤注意固定剂是否含乙醇或以水配制。四、脱水：（一）脱水的目的：利用脱水剂置换及驱除组织中的水分，以利于透明和浸蜡。（二）脱水的步骤：一般大小约为1.5cm×l.8cm×0.2cm的组织，其脱水步骤和时间如下： 70乙醇12h 80乙醇24h 90乙醇24h 95乙醇24h无水乙醇24h（三）脱水的注意事项： 1、浓度梯度 2、彻底干净 3、时间适度 4、有盖瓶子 5、达到无水 6、其它五、透明（一）透明的目的 组织块在浸蜡前，必须通过透明以便使石蜡浸入组

9、织内，起充分支持硬化组织块的作用，以便完整切片。 通常根据透明时间与肉眼观察相结合判断透明程度。（二）常用透明剂的种类和使用方法 最常用的是二甲苯，另外还有甲苯、苯、氯仿、香柏油、松节油、汽油等。六、浸蜡（一）浸蜡的目的 组织经过脱水、透明后要用石蜡、火棉胶、碳蜡等支持剂透入内部，使其变硬并将组织包埋进去以利于切片和观察，这个过程称为“透入（浸蜡）”或“包埋”。 （二）浸蜡的方法将组织经过透明以后立即投入到液体石蜡中去。在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡、），这样可以使石蜡中剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片质量。（三）浸蜡剂的种类1、石蜡 石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为56以

10、上的石蜡。低熔点在54以下，用于酶的显示和保存抗原活性。 2、火棉胶 目前使用火棉胶透入组织较少，用于染色前的覆盖液较多。 3、碳蜡 4、明胶七、包埋 （一）包埋的目的：用石蜡将经过固定、脱水、透明、浸蜡后的组织包绕成长方体块状以便于切片。石蜡是动物植物、人体组织制片技术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净蜡，包埋较为理想，其包埋蜡熔点为5658。将经过固定、脱水、透明、浸蜡后的组织用石蜡埋入，待组织冷却、变硬，这样组织可以获得一定的硬度，以便切成薄片。 （二）石蜡包埋的注意点：1、动作要迅速。2、注意切面。3、加温镊子。4、组织不能重叠。5、包埋用蜡一般为工业蜡

11、。八、切片（一）切片前的准备工作1、修块：石蜡切片前应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，组织四周留2mm的石蜡边。 2、粘块（二）切片操作包括切片、展片和烤片。1、切片：将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度(一般为4m)的薄片称为切片。切片机多为轮转式切片机或平推式滑动切片机。2、展片：将已切妥的切片在温水中铺展平整后，用载玻片捞起附贴其上称为展片。3、烤片稍晾干后再用烤片机烤片，使其牢固附着，称为烤片。冰冻切片技术冰冻切片在组织学技术中应用范围较广，对病理学中的临床手术的快速诊断其意义更大。 冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷

12、却后再进行切片。一、冷冻切片的目的1、在手术进行中的病理确定。2、了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或转移的程度。3、了解恶性肿瘤手术范围。4、诊断剖腹探查时所发现的异样组织。5、显示组织中的脂肪和脂类物质。如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。6、某些酶的显示。7、神经病理学技术中的某些染色法。8、免疫荧光的研究。 二、实验方法1、准备：将仪器打开，样品台温度调至-40。2、取材：组织必须新鲜，尽可能不经水洗。取材时应避免组织挤压，防止人为假象 。样品大小5×5×3mm。3、速冻：将样品放在样品台上，样品四周加水加固，冷冻510min。4、切片：升高温度至- 15（视样品而定）

13、，约5min后开始切片，厚度615m。5、 制片：将切片直接放在载玻片上。6、 固定液（丙酮）中固定12min。7、染色观察 8、记录：将观察的结果记录实验报告上。切片温度的设定原则：1、柔软、含水较多的组织设定温度高。2、致密、富含脂肪的设定温度低。冰冻切片的特点：优点：1、简便。2、快速。3、组织变化不大。4、能很好保存脂肪，类脂等成分。5、较完好地保存各种抗原活性及酶类。不足：1不容易做连续切片。2切取的组织不能过大。3不容易制作较薄的切片。4组织结构不如石蜡切片清晰。超薄切片的制作技术简介一、透射电镜样品制作操作流程取材漂洗（生理盐水）前固定（2.5%戊二醛，4ºC冰箱2小时以上）漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）后固定(1%锇酸1小时左右)漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）块染（1%醋酸铀2小时）梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 ºC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37ºC烘箱过夜；纯包埋液45