细胞工程-第13章-mdf

1、体外单倍体诱导与单倍体育种体外单倍体诱导与单倍体育种第第13章章 主要内容：单倍体的体外诱导方法和单倍体育种技术； 重点：花药和花粉的培养方法 难点：小孢子母细胞的发育过程；体外单倍体诱导体外单倍体诱导 利用离体培养花药或小孢子来诱导形成单倍体植株。花粉植株的形态发生方式 （1）愈伤组织型 花粉粒愈伤组织单倍体植株 （2）胚状体型 花粉粒胚状体单倍体植株 （3）混合型 花粉粒愈伤组织单倍体植株 花粉粒胚状体单倍体植株单倍体育种(haploid breeding) 单倍体植物，经过人工染色体加倍，形成纯和二倍体，从二倍体中筛选优良个体，繁育成新品种；或者利用优良的纯和二倍体作为杂交育种的原始材料

2、。单倍体育种的优点 便于控制杂种分离，缩短育种周期； 利于排除显隐性基因干扰，提高选择效率； 利于加快自交系选育； （通过多代自花授粉或多代近交后所得到的纯系） 易于作为诱变育种的材料； （用物理、化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法 ）主要内容 13.1 植物小孢子的发育植物小孢子的发育 13.2 花药和花粉培养花药和花粉培养 13.3 花药和花粉培养方法花药和花粉培养方法 13.4 单倍体育种在生产实践中的应用单倍体育种在生产实践中的应用13.1 植物小孢子的发育植物小孢子的发育 小孢子发育过程： 高等植物

3、初生造孢细胞多次有丝分裂 小孢子母细胞(体积大、核大、质浓、无液泡) 减数分裂开始，纤维素初生壁溶解，形成胼胝质壁 连续两次分裂，DNA量由4c下降为1c，染色体数由2n变成n。小孢子母细胞发育到成熟的花粉粒的过程 分为三个时期 第1期，小孢子母细形成四分体（四分体期） 小孢子母细胞减数分裂厚的胼胝质包裹的小孢子四分体胼胝质分解,四个小孢子分离。第2期、分离的单个小孢子发育(单核期) 单核早期、中期 起初为薄壁球形小孢子，细胞核大而圆居细胞中央； 单核晚期(单核靠边期)：细胞质出现液泡，并逐渐变大，细胞核被挤到一边，细胞变为纺锤形。 A型花粉粒，第2期末，细胞明显增大，花粉细胞第1次有丝分裂(

4、不均等分裂) 。小孢子细胞壁外表不断沉积孢子花粉素，构成坚韧外壁，外壁内是纤维素构成的内壁。第3期，小孢子发育为花粉粒(双核期或三核期) 第3期，进入标志为小孢子细胞中出现明显双核。 核于近壁处分裂，近壁的核小为生殖细胞核(配子体)；中央核为营养细胞核。 到一定阶段，生殖细胞进入营养细胞细胞质，营养细胞的液泡分散消失。不同时期，生殖核第2次有丝分裂为两个雄配子，可成为成熟的两细胞花粉和三细胞花粉。资料 约有70%的被子植物当花粉成熟时只有营养细胞和生殖细胞，如棉、桃、梨、柑橘、茶、大葱、大豆、百合等，此时称为二核期花粉粒。 另外一些植物的花粉在散出之前，其生殖细胞再进行一次有丝分裂，产生2个精

5、细胞，它们是以含有1个营养细胞和2个精细胞进行传粉的，被称为三核期花粉粒，如玉米、水稻、油菜、小麦、向日葵等。二核期花粉粒和三核期花粉粒通常又被称为雄配子体，精子则称为雄配子。 13.2 花药和花粉培养花药和花粉培养 13.2.1 花药培养 13.2.2 花粉培养 13.2.3 小孢子母细胞培养花药培养 anther culture，将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。 13.2.1 花药培养 花药培养的优缺点： 优点：不需要游离花粉处理，比花粉培养方便快捷。为单倍体培养的主要手段。 缺点：需要对后代进一步筛选。因为可能得到花药

6、体细胞来源的二倍体植株。 花药培养基常用类型： 琼脂固体培养， 液体培养， 固液双层培养。获得花药再生单倍体植株的两种方式 器官再生：花粉先形成愈伤组织，分化形成植株；如小麦，水稻等。 胚状体再生：花粉先形成胚状体，发育成植株。如烟草等。 胚状体发生途径优点：数量多、速度快、结构完整、再生率高等。 胚状体再生的两个特点： 两极性，胚状体发生起初，即具有根端和芽端； 具有完整植株的特点，与外植体维管束无直接联系。13.2.2 花粉培养 花粉培养(pollen culture)：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。1，裸子植物的花粉培养 研究现状：研究较少，难度较小

7、。 花粉培养的典型树种：麻黄、银杏、紫杉、榧等。 裸子植物花粉培养的愈伤组织特点：常为无色愈伤组织，可连续继代培养，有少量含叶绿体；常为不对称细胞分裂，其中较小细胞重复分裂，常出现染色体多倍化和其他染色体畸变。 裸子植物花粉获取方法：取小孢子囊或幼小球果75酒精消毒1min0.5漂白粉浸泡5 min无菌水冲洗，无菌滤纸吸干剖开孢子囊置于无菌容器，4干燥器贮存花粉散落后，收集花粉。2，被子植物的花粉培养 研究现状：研究较多，离体培养难度较大。 被子植物成熟花粉离体培养常用方法：悬滴、看护或植板培养法等。Kameya等(1970)悬滴培养法 成熟花粉粒获得与培养：取甘蓝幼嫩花蕾，消毒后无菌滤纸包裹

8、，待花药开裂散出成熟花粉粒，收集悬浮于液体培养基，花粉粒5080粒/悬滴。4接种(防花粉破裂)，20暗培养，至形成细胞团。 培养基：改良Nitsch培养基，附加酵母提取物和椰乳，蔗糖浓度1015。Sharp等(1972)看护培养法花粉粒获得与培养：取1cm长番茄花蕾，消毒后划破花药取出花粉，制成每ml含20粒花粉的悬浮液。 看护培养：琼脂培养基上放消毒番茄花药，花药上放滤纸，滤纸上滴0.5ml悬浮液。 培养条件：25和光照。约28d，滤纸上长出绿色薄壁细胞组成的细胞群落。 培养基：White无机盐、MS铁盐、泛酸钙0.1mgL、烟酸5.0mgL、盐酸硫胺素4.0mgL、盐酸吡哆醇1.0mgL、

9、肌醇100mgL、2,4-D6.0mgL、蔗糖4、琼脂0.8。水稻和烟草花粉采用植板培养法 等量花粉悬浮液和琼脂培养基(45)混合，倒入平培养皿冷却，25下培养。 逐渐可形成细胞团，然后继续分化为球形胚或愈伤组织。13.2.3 小孢子母细胞培养 应用：研究减数分裂和花粉发育。为单倍体育种和诱变育种提供材料。 1967年Ito和Stern培养无瓣延龄草和麝香百合的小孢子母细胞获得成功，得到四分体小孢子。 研究方法： 取材：取长1224mm麝香百合花蕾75酒精浸泡消毒1min 剥开花蕾取出花药，切开花药一端轻压使小孢子母细胞从切口处挤出(带状细胞团即为减数分裂前期的小孢子母细胞)。 培养：Whit

10、e液体培养基，20静置培养715d，分化出四分体小孢子细胞。变温处理 Nitsch等采用变温处理方法改变小孢子母细胞的发育途径，并诱导出胚状体。 研究方法：曼陀罗或烟草植株20转入3和5，各处理23d烟草花芽在处理后，培养37d，约有12花粉粒具有均等核。 而未经处理的花粉粒在同样条件下培养只有约5均等核。一种有效的油菜小孢子分离系统 油菜花苞表面消毒 含蔗糖13液体培养基中研磨均质化 离心收集释放出来的小孢子 相同培养基洗涤和培养。13.3 花药与花粉的培养方法 13.3.1 材料选择 13.3.2 材料预处理 13.3.3 培养基 13.3.4 接种与再生植株的培养13.3.1 材料选择

11、3.1.1供体材料的遗传差异 花药培养成败的决定性影响因素：母本材料遗传背景。 不同物种间差异以及不同品种间的差异 如，茄科曼陀罗属、烟草属和禾本科的水稻容易诱导；但其属内种间或品种间也有明显差异性。 杂种优势：一般杂种比纯种容易诱导花药培养。 如，三叶橡胶、小麦等杂种一代的花粉愈伤组织诱导率，远超其亲本花粉诱导率。 花药培养力(即愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率、植株诱导率等)是受多基因控制的数量性状，随基因型差异而变化较大。2。母本生理状态的影响花粉培养力高的母本材料： 双子叶植物的早期花蕾花药中花粉。 健壮母本花粉。 母本氮素营养处于饥饿状态。 高纬度、高海拔地区栽培小麦花药；春播的

12、冬小麦比秋播花粉植株诱导率高。 田间栽培比温室栽培更有利于花粉诱导。 环境因素：花粉母细胞减数分裂时期的光周期、温度、营养状况。3。花粉发育时期 被子植物花粉发育的三个阶段： 第一期：四分体时期； 第二期：单核期(小孢子阶段)； 此期又分为单核早期，中期(中央期)和晚期(单核靠边期) 第三期：双核期和三核期(雄配子体阶段)3。花粉发育时期 花粉诱导的关键时期：单核靠边期(单核晚期)。多数植物，较易培养成功时期为单核期花粉(包括早、中、晚期) 。 选材方法：对于有限数目花药植物，需根据花蕾大小不同，找出小孢子发育时期不同的花药(因花蕾形态与花粉发育时期间有对应关系)。 例，烟草花蕾花冠花萼长度、

13、水稻颖花发育、小麦拔节、棉花现蕾、花生开花等现象。13.3.2 材料预处理 常用方法： 1、低温处理 2、高温处理 3、离心处理 4、激光照射 5、乙烯利处理 6、甘露醇处理1、低温处理： 能明显提高花粉胚的诱导率。 不同材料采用的低温处理温度和时间具有差异性： 烟草花药79下处理714d。水稻花药1O处理2h至14d。小麦、黑麦、杨属花药13处理220d，如高于5预处理，花粉将沿正常途径发育而越过诱导敏感期，不利于诱导。百合、大豆、大麦4处理48h。石刁柏6处理6d。低温处理提高花粉诱导率的作用机制 存在两种观点。 Nitsch等(1973)认为，低温可变花粉粒第1次有丝分裂纺锤体的取向，使

14、花粉粒的极性分化不起作用，形成两个均等细胞，使花粉朝着形成胚胎的方向发育。 Sunderland等(1978)提出，低温处理有丝分裂时的或刚完成有丝分裂的花粉效果比处理单核期小孢子更加明显。因此认为低温作用是保持花粉的活力，在此期间营养细胞得以完成细胞质改组转向脱分化胚胎发生。2、高温处理 芸薹属植物游离小孢子培养：较高温度(32)处理3d后，再于25正常培养，可大幅提高花粉胚得率。 Liu(刘公社1995)实验表明，游离小孢子的高温预培养敏感期：培养最初2448h。而在正常培养48h后，再给予高温则不发生作用。3、离心处理 Tanaka等(1973)将单核后期烟草花粉,在转速1011kr/m

15、in离心30min，产生花粉小植株的频率从30.5提高到38.2，每个花药产生的小植株的数目从1.6株提高到5.4株。 杨一平等(1980)对杨树花药接种前，2kr/min离心20min，对花粉启动有良好效果。 离心对花粉诱导的作用机理：仍不清楚，可能是花粉孤立化，给花粉启动创造了条件；也可能因为离心改变了花粉轴向，使花粉均等分裂(离心对双核期花粉无效)。4、激光照射 ：陈震古等(1999)对黑杨派、白杨派、青杨派等18种杨树离体花药用He-Ne20(Jcm-2)激光照射，表明激光能促进花粉愈伤组织的芽分化。5、乙烯利处理 ：Bennett等(1972)发现减数分裂前用乙烯利(2-氯乙基磷酸)

16、喷施小麦植株，能促使花粉细胞核分裂，将这些花药放于培养基培养可得到8个核花粉。王敬驹等(1974)用4g/L乙烯利处理水稻植株有促进花粉愈伤组织形成的作用。6、甘露醇处理 卫志明等(1993)首先提出，甘露醇预培养对小麦游离小孢子培养有促进作用。用0.3mol/L甘露醇处理小麦游离小孢子5d，移入培养基培养，诱导出花粉植株。对照用蔗糖培养基处理，没有花粉胚形成；且甘露醇和蔗糖混合液处理小孢子也不能形成花粉胚。13.3.3 培养基 1、基本培养基：不同组成对花药培养有明显影响，但不同研究结论不一致。 常用花粉培养基本培养基：MS(较广泛采用，常被改良)、Nitsch、B5、BN、BH、MB、N6

17、(禾本科)、H(杨属)、Miller等。 马铃薯培养基，有利小麦、水稻花粉愈伤组织诱导，但诱导分化频率很低。 成分：20马铃薯汁、铁盐(同MS培养基)、2mg/L2,4-D、0.5mg/L激动素、9%蔗糖。在培养水稻花粉时蔗糖浓度降低为35。 改进的马铃薯培养基：加入了一定量的无机盐，可用于小麦花药愈伤组织诱导和分化。(1)碳源 最常用碳源：蔗糖，常用210。 例，烟草和水稻花粉愈伤组织形成和分化的蔗糖适宜浓度是25；马铃薯、油菜、小麦、小黑麦、大麦的花药则为612。玉米花粉愈伤组织产生需要1215，甘蔗花药培养基中可高达20。 蔗糖的作用：碳源；渗透调节剂；诱导花粉植株。 一般，较高浓度蔗糖

18、有利于提高花粉愈伤组织诱导效率，同时抑制花药体细胞增殖。 其他碳源： Hunter发现在大麦、粳稻、小麦花药培养中麦芽糖比蔗糖更为有效。 朱至清等(1990)提出，用葡萄糖替代蔗糖可以大幅度提高冬小麦花药产生花粉胚的频率。(2)激素 花药培养的不同阶段，所用激素的种类和浓度不同。而不同植物种类，激素种类和浓度的选择差异很大。 I.脱分化培养基：需细胞分裂素(低)和生长素(高)共同作用。 生长素类：2,4-D、IAA、IBA、NAA等。 细胞分裂素类：KT、6-BA等。 浓度范围:O.16.0mgL II.分化培养基：细胞分裂素为主要诱导激素，可配合使用生长素或其他激素。 例，陈正华等(1979

19、)橡胶花粉培养中添加0.5mg/LGA3；吴蝴蝶等(1994)培养基中添加O.20.5mg/LABA。 III. 诱导生根：生长素类单独或配合使用，浓度0.0253.0mg/L。(3)附加成分 有益花粉愈伤组织生长的有机附加物： 水解酪蛋白或水解乳蛋白(300500m/L)、酵母提取物(5001000mgL)、肌醇(100mgL)、谷氨酰胺(500800mgL)等。 抗氧化剂：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、维生素C等，阻止褐化。 吸附物质：活性炭，利于促进花粉植株的产生。2、条件培养基 条件培养基(condition culture medium)：利用组织培养物产生分泌物进入培养基，使得培养基条

20、件化，成为条件培养基。经条件化的培养基可促使培养细胞分裂和分化。 许智宏等(1981)报道的条件培养基培养： 双核早期的大麦花药接种到马铃薯或N6液体培养基(含1.5mgL 2,4-D和0.5mgL激动素)上培养，培养7d后取出花药，离心去除散落的花粉和细胞碎片，得到条件化液体培养基。 然后将单核中期花药接种到条件培养基，8090大麦花药形成愈伤组织，而对照液体培养基上仅5花药有反应。13.3.4 接种与再生植株的培育 1、材料的灭菌处理 1)510漂白粉水溶液上清液浸泡1015min； 或者 810安替福民(次氯酸钠溶液)浸泡510min； 或者 0.1升汞浸泡10min。 2)无菌水冲洗3

21、5次。 3)超净工作台上取出花药接种。 接种密度要适当大，以发挥集体效应。2、培养条件 温度：一般较高温度有利于愈伤组织形成，适宜温度为2830。 光照：不同植物对光照的反应不一，常弱光培养。光照长短、光照强度和光质对花粉诱导研究很少。3、花粉植株的培育 花粉植株(pollen plant)诱导产生的两条途径： 花粉胚(pollen embryo)产生小植株： 植株性状：直接从花药囊中长出，茎叶细弱，根系不发达，不能直接移植到土壤，需分苗移栽。 培育炼苗：小苗单棵或数棵，无菌条件移栽到不含激素T培养基(或MS)，待小苗长出45片真叶和一些根后移栽到花盆或苗床上。 移栽后，遮荫防晒，保持土壤和空

22、气湿度。花粉愈伤组织(pollen callus)产生小植株 培育过程： 愈伤组织生长1520d转移到分化培养基(愈伤组织培养时间越长，越不利于分化)。 分化培养基上，1020d可看到芽分化。 生根培养基上，芽基部长出不定根。 待根系生长到一定程度后移栽。 移栽后管理的一般措施： 移栽初期，保持较高的土壤和空气湿度，光照不宜过强。而对于温度则差异加大。 随着幼苗的生长，逐渐改变培养条件，使之适应自然的栽培状况。4、花粉植株的鉴定 原因：存在体细胞干扰和生殖细胞自发加倍现象。 鉴定方法： 形态鉴定：依据单倍体植株外貌特征(瘦弱、叶片窄小、花小珠头长)、结实性特点(开花但不结实)、花粉粒着色和大小(花粉败育、不着色、花粉粒小于正常二倍体)、气孔大小数目(倍性越高，气孔越大、气孔密度越小)； 细胞学鉴定：根尖有丝分裂中期染色体数目和染色体行为； 杂交鉴定法：根据后代分离的比例对再生株进行鉴定； 分子标记鉴定：利用同工酶谱分析、RFLP(restriction fragment length polymorphi