微生物学期末资料

1、 第一章 微生物工程菌种 四菌种选育：应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株 1、自然选育：某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应（由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应）和互变异构效应（自然突变两种情况：菌种的衰退和生产质量下降生产性能提高） A、自然选育的一般程序：制备单

2、孢子（单细胞）悬液、适当稀释、在固体平板上分离、挑取部分单菌落进行生产能力测定、经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株 B、自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高 2、诱变育种：人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法 A、诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺 B、诱变育种的一般步骤：原始菌株（出发菌株）、细胞或孢子悬液制备、诱变剂处理、中间培养、突变株分离、初筛、复筛

3、、生产性能试验 （1）出发菌株的选择：选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株；最好选用已经过生产选育的自发突变菌株；采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等；由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株 （2）单细胞（或单孢子）悬液制备：采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理（原因：分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂、可避免长出不纯的菌落。） 处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态，细胞菌龄一般在对数期。霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。若在处理前细胞进行前培养，则变异

4、率可大大提高 （3）诱变剂及使用剂量的选择 a.诱变剂：凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素 物理诱变剂：紫外线、X-射线、g-射线、快中子、超声波等 化学诱变剂：硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等 紫外线：使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广。作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡 亚硝酸：常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基 b.确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。 对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。在使用

5、高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定（凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量） c.处理方法： 单一诱变剂处理 复合处理：1）两种或多种诱变剂先后使用；2）同一诱变剂重复处；3）两种或多种诱变剂同时使用 （4）诱变处理后的后培养 表型迟延现象：生理性、分离性 遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来；诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效；必须在完全培养基中进行培养才能稳定变异，使菌株表现出高的突变频率。 （5）

6、变异菌株的筛选 a.初筛：迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，着眼于尽量扩大挑选范围。一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。 b.复筛：选出产量最高的1-2个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试 3几种重要突变株 a经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，这些变异均可用各种方法筛选出来. （1）、营养缺陷型菌株的筛选：育种标记、影印培养法、夹层培养法、逐个检出法 （2）、抗性突变株的筛选：育种标记、提高某代谢产物的产量（筛选

7、检出抗药性突变株可用梯度培养皿法）。筛选抗噬菌体突变株：以高浓度噬菌体平板筛选抗性菌株 （3）、温度敏感突变型筛选：仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。 TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同（原因:TS突变株的一种重要酶蛋白在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化的；这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降低了原有的抗热性；TS突变株在代谢过程中的各个环节，某种酶的合成或功能由温度所控制） （4）、抗反馈调节突变株的筛选：（通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的） 反馈

8、抑制酶的活性；反馈阻遏酶的合成 a.解除反馈阻遏：调节基因或操纵基因发生突变， 使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因 b.解除反馈抑制：结构基因突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用；但不能代替末端产物参与生物合成 抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下，仍可合成末端产物 （5）、组成型突变株的筛选：调节基因或操纵基因发生突变，都有可能获得组成型突变株（通过显色反应可在平板上识别组成型菌株：在不含诱导物，但含有经酶解后能呈现颜色变化的底物的平板上进行培养

9、，可方便快速地检出组成型菌株） 筛选原则： 设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变株 pH对发酵的影响及其控制 一、pH对菌体生长和产物合成的影响 1）pH影响酶的活性：当pH抑制菌体中某些酶的活性时，使菌体的新陈代谢受阻 2）pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行 3）影响培养基某些组分和中间产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用 4）pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变 二、发酵过

10、程中pH的变化及影响pH变化的因素 1、发酵过程中pH的变化 1）生长阶段：pH有上升或下降趋势（相对于接种后起始pH而言） 2）生产阶段：pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围 3）自溶阶段：随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。2、引起发酵液中pH变化的因素 发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、培养基的组成和发酵条件 a.引起pH下降的因素（凡是导致酸性物质生成或释放及碱性物质消耗的发酵，其pH都会下降） 1）培养基中碳氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降 2）

11、消泡油加得过多 3）生理酸性物质的存在，氨被利用，pH下降b.引起pH上升的因素：（凡是导致碱性物质生成或释放及酸性物质消耗的发酵，其pH都会下降） 1）培养基中碳氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使pH上升 2）生理碱性物质存在 3）中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多使pH上升选择合适pH值的准则是有利于菌的生长和产物的合成，以获得较高的产量三、pH的控制 1、在基础培养基配方中考虑到维持pH的需要 例如加入CaCO3，使用缓冲液等 2、通过补加酸、碱来调节控制 3、通过中间补料来控制四、溶氧浓度对发酵的影响及控制(看书) A、溶氧测定的意义 1、溶氧作为发酵中氧是否足够的度量，了解菌

12、对氧利用的规律 2、溶氧作为发酵异常情况的指示 3、溶氧作为发酵中间控制的手段之一 4、溶氧作为考查设备、工艺条件对氧供需与产物形成影响的指标之一五、泡沫对发酵的影响及控制 A、泡沫对发酵的影响 1）降低了发酵罐的装液系数；2）增加了菌群的非均一性；3）增加了污染杂菌的机会；4）导致产物的损失 B、影响泡沫的因素 1）与通气量、通气速度和搅拌速度等有关 2）与所用培养基的成分有关 3）与培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间有关 C、泡沫的控制 1、机械消泡 优点：不需引入外界物质（如消泡剂），可减少培养液性质复杂化程度，便于产物的提取。缺点：不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素 2、化学消泡消泡机理

13、：1）降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂；2）降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂 D、消泡剂选择的原则： 对发酵过程无毒，对人、畜无害，不影响生物合成。 消泡作用迅速，效果高和持久性能好。 能耐高压蒸汽灭菌而不变性，在灭菌温度下对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物。 不影响以后的提炼过程。 不干扰分析系统，如溶解氧、pH测定仪的探头。 消泡剂的来源多，价格低，添加装置简单。 最好还能做到不影响氧的传递 溶剂萃取方式：单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取 生物反应器 （发酵罐） 一分批操作：向反应器中一次投入所需的培养基，然后接种培养，培养过程中除控制温度和pH外不进行其他任何控制，反应

14、结束后将全部培养液排出进行处理 缺点： 效率低 尽管微生物的活性和机能因其所处的环境大幅度变化，也根本不控制培养基组分浓度等环境因素，而任其自然变化，这样不利于生产。 在每一批主反应（生产阶段）之前，必须进行几级种子培养。 优点：操作相对较易 二、连续操作：连续不断地补加新鲜培养基，连续不断地排出培养物 优点：1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。缺点：1）菌种的变异；2）实际运行时间；3）反应器传质能力（连续发酵对设备的密封性、培养液和空气的无菌度要求严

15、格，目前使用的空气过滤器不能完全保证（长时间）100%的除菌效）；4）丝状菌丝的阻塞（加入连续发酵罐的培养基与罐内发酵液的混合不均匀，即均匀度不够，就会使罐内各部分的微生物生长不一致，某部分微生物得不到充分的营养而引起操作不确定并降低产率。对于高黏度发酵液均匀度不够的情况更为严重。） 临界溶氧浓度：当不存在其他限制性基质时，如果溶氧浓度高于某定值，细胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶氧浓度低于该值，细胞的比耗氧速率就会大大下降；则该值即为临界溶氧浓度 发酵热：发酵过程中释放出的净热量或单位体积的发酵液在单位时间内释放出来的净热量。 生物热：产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热 前体：在微生物的生物合成过程中，某些化合物