AmpC酶的研究进展

1、1AmpCAmpC酶的研究进展酶的研究进展叶叶 英英1 1 研究研究AmpCAmpC酶的科学意义酶的科学意义2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因与表达4 AmpC酶的发展简史5 AmpC酶的检测6 产AmpC酶菌的治疗与预防 开发一种新抗生素需要10年 需花费5-10亿美元 一代耐药菌的产生只要2年时间后抗生素时代已经来临？！后抗生素时代已经来临？！携带NDM-1的超级大肠埃希菌细菌耐药的主要机制细菌耐药的主要机制灭活酶产生灭活酶产生孔蛋白改变孔蛋白改变主动外排主动外排其他机制其他机制靶点改变靶点改变灭活酶种类灭活酶种类v -内酰胺酶内酰胺酶v氨基糖苷类钝化酶氨基糖苷类钝化酶: 磷酸转

2、移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶v氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶v其它：磷霉素、红霉素乙酰化酶其它：磷霉素、红霉素乙酰化酶 林可霉素、克林霉素乙酰化酶等林可霉素、克林霉素乙酰化酶等 - -内酰胺酶：最主要的灭活酶内酰胺酶：最主要的灭活酶v目前已发现目前已发现300多种多种v新的种类不断出现新的种类不断出现v对对 -内酰胺抗生素造成严重威胁内酰胺抗生素造成严重威胁临床关注的重要临床关注的重要 - -内酰胺酶内酰胺酶v超广谱-内酰胺酶(ESBLs)v高产头孢菌素酶(AmpC酶)v碳青霉烯类酶(Ambler B类 金属酶; Ambler A,D类 -内酰胺酶)1 研究

3、AmpC酶的科学意义2 AmpC2 AmpC酶的生化特性酶的生化特性3 AmpC酶的基因与表达4 AmpC酶的发展简史5 AmpC酶的检测6 产AmpC酶菌的治疗与预防AmpC酶的定义酶的定义v是由革兰阴性细菌(肠杆菌科细菌,铜绿假单胞菌等)的染色体或质粒介导产生的一类内酰胺酶，属Bush分类（底物谱分类法）Group 1，Ambler分类（分子结构分类法）Class Cv首选作用底物是头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制, 因此在国内又称作头孢菌素酶。v因可被某些内酰胺类抗生素诱导产生,又称诱导酶。AmpCAmpC酶生化特性酶生化特性v相对分子量(Mr)介于38-42 KDa。v灭活-内酰胺酶抑制

4、剂，如对克拉维酸等不敏感.v正在研究开发的硼酸类抑制剂 BRL42715、 RO48-1265、RO48-1220对其有较强的抑制作用。AmpCAmpC酶生化特性酶生化特性v对青霉素类抗生素除氮脒青霉素（美西林）或脒基青霉素（替莫西林）外均耐药。v对多种三代头孢菌素和单环类抗生素耐药。v对头霉素类耐药。v对第四代头孢菌素一般表现为敏感。v对碳青霉烯类抗生素敏感。但细菌高产AmpC酶结合外膜孔蛋白缺失可导致对其耐药。产产ESBL与与AmpC的耐药谱差别的耐药谱差别 ESBL AmpC 耐药谱耐药谱多重多重 多重多重v对三代头孢对三代头孢多耐药多耐药 耐药耐药v头孢吡肟头孢吡肟多敏感多敏感 敏感敏

5、感v哌酮哌酮/舒巴坦舒巴坦大多敏感大多敏感 耐药耐药v哌拉哌拉/他唑巴坦他唑巴坦大多敏感大多敏感 耐药耐药v头霉素头霉素大多敏感大多敏感 耐药耐药v碳青霉烯类碳青霉烯类敏感敏感 敏感敏感产产AmpCAmpC酶细菌感染的患者死亡率显著升高酶细菌感染的患者死亡率显著升高32%15%P=0.03死亡率死亡率% %非耐药菌非耐药菌产产AmpCAmpC酶耐药菌酶耐药菌产产AmpCAmpC酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的2 2倍倍1 研究AmpC酶的科学意义2 AmpC酶的生化特性3 AmpC3 AmpC酶的基因与表达酶的基因与表达4 AmpC酶的发

6、展简史5 AmpC酶的检测6 产AmpC酶菌的治疗与预防AmpC酶的基因构成酶的基因构成v由5个不连锁基因即 ampC、ampR、ampD、ampE 和ampG组成vampC是AmpC酶的结构基因，编码产生AmpC酶蛋白v基因ampR、ampD、ampE、ampG 是AmpC酶的调节基因，参与调控AmpC酶的合成过程。AmpC酶的基因构成酶的基因构成vampR是AmpC的转录调节因子，属于LysR调节子家族。AmpR在非诱导状态下作为ampC转录的抑制因子，而在诱导状态下作为转录激活因子存在。vampD是AmpC表达的负调控基因，位于远处染色体上，参与肽聚糖代谢。ampD的基因序列与AmpC酶

7、的表现型密切相关。AmpC酶的基因构成酶的基因构成vAmpE蛋白充当一个感受器，协助ampD完成对ampC的阻遏作用，在整个调节系统中居次要地位。 vampG编码转膜蛋白AmpG,具有透性酶活性，感受肽聚糖量的变化，在AmpC酶的表达中起着向胞浆内传递诱导信号的作用。染色体染色体AmpC酶表达类型酶表达类型（1）诱导高产型: 低基础水平和高诱导产生（2）持续高产型: 高基础水平持续表达， 亦称：稳定的去阻遏表达型（3）持续低产型: 低基础水平持续表达（1 1）诱导高产型）诱导高产型 当有诱导作用的内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范围在1001000倍之间。（2）持续

8、高产型）持续高产型 原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因发生突变,产生有缺陷的AmpD蛋白,不能与AmpR调控蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。（3) 持续低产型持续低产型 部分产AmpC酶的菌株持续低水平的产生AmpC酶,其原因可能是缺乏ampR基因或ampR基因发生突变,产生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无内酰胺类存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有内酰胺类存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水平表达。1 研究AmpC酶的科学意义2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因与表达4 AmpC4 AmpC酶的发展

9、简史酶的发展简史5 AmpC酶的检测6 产AmpC酶菌的治疗与预防AmpC的发展简史的发展简史v20世纪90年代前，为染色体型。v90年代后发现质粒型，呈持续高表达,并在同种和 不同种细菌间水平播散，造成更严重的耐药性。v质粒型AmpC种类在不断增加，目前已达50余种。v产质粒型AmpC酶细菌：没有或具有不健全AmpC染色体的细菌种属具有健全AmpC染色体的细菌。质粒质粒AmpC酶流行背景酶流行背景v1989年Bauenfeind等报道了质粒AmpC酶CMY-1， 但没有提供其生化特征。v第一个公认的质粒AmpC酶是1988年在美国普罗维登斯一家医院由Papanicolaou等从肺炎克雷伯菌中

10、发现的MIR-1。v从此以每年发现13个新质粒的速度增加。质粒质粒AmpC酶的世界流行状况酶的世界流行状况非洲非洲ACC-1，CMY-4亚洲亚洲MOX-1，DHA-1，ACT-1 , FOX-2，CMY-I/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26欧洲欧洲BIL-1，CMY-2/3/4/5/12/13，DHA-1/2，FOX-2/4，LAT-1/3/4，MOX-2，ACC-1美洲美洲MIR-1，ACT-I，FOX-1/2/5/6/8/10，CMY-2/3/4/5/19/20/23/24/25我国我国pAmpC酶的检测状况酶的检测状况北京协和医院北京协和医院ACT

11、-1， CMY-2首都医科大学首都医科大学DHA-1，CMY-2中山医科大学中山医科大学DHA-1,ACT-1,CMY-2浙江医科大学浙江医科大学DHA-1，CMY-2/4/11上海市传染病医院上海市传染病医院安徽医科大学安徽医科大学DHA-I， CMY-2DHA-1，ACT-1/2，CMY-2，MOX-4，ACT-6pAmpC酶的来源酶的来源v系统进化树研究表明：pAmpC酶和某些菌属的染色体AmpC酶有着高度的同源关系。v根据和不同菌属的染色体AmpC酶的同源关系，pAmpC酶可分为以下5组：pAmpC酶的分类酶的分类弗氏枸橼酸杆菌组弗氏枸橼酸杆菌组LAT-1/2/3/4、CMY-2/3/

12、4/5/6/7/9、BIL-1阴沟肠杆菌群组阴沟肠杆菌群组MIR-1、ACT-1气单胞菌属组气单胞菌属组MOX-1/2、FOX-1/2/3/4/5/6、CMY-1/8/11摩根摩根菌组摩根摩根菌组DHA-1/2蜂房哈夫尼菌组蜂房哈夫尼菌组ACC-1pAmpC酶的来源途径推测酶的来源途径推测v推测质粒介导的AmpC酶基因是来源于染色体的，目前大量的线索表明可能是通过整合子实现的。v整合子(Integron)是近来新发现的能将耐药基因传递给其他细菌同时还能接受其他细菌的耐药基因，是细菌遗传进化天然克隆和表达系统。1 研究AmpC酶的科学意义2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因与表达4 Am

13、pC酶的发展简史5 AmpC5 AmpC酶的检测酶的检测6 产AmpC酶菌的治疗与预防 AmpC酶的检测方法酶的检测方法v表型检测v基因检测vpAmpC酶确认需分两步: (1) 明确是否为高产AmpC酶 (2) 是否为质粒介导: 通过质粒接合实 验、Southern杂交证实 AmpC酶的检测方法酶的检测方法 表型检测方法: 头孢西丁敏感实验 头孢西丁三维试验 头孢西丁敏感试验头孢西丁敏感试验v操作：按操作：按CLSI标准操作标准操作v判断：判断：K-B法法16g/ml为为 耐药耐药 v意义：耐意义：耐FOX的菌株有可能产生的菌株有可能产生AmpC酶酶v缺点：特异性差缺点：特异性差头孢西丁三维试

14、验头孢西丁三维试验 将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液涂布于M-H平板上，取30g头孢西丁纸片置于平皿中心，用刀片在离纸片边缘5mm处放射状地由里向外切割一道狭缝，取40微升受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将MH平板放入35孵箱过夜。头孢西丁三维试验头孢西丁三维试验 结果判断：结果判断： 出现出现ATCC25922箭头样生长，箭头样生长， 为三维试验阳性。为三维试验阳性。 是目前公认的检测是目前公认的检测 高产高产AmpC酶的经典方法。酶的经典方法。AmpC酶的检测方法酶的检测方法 基因检测法: 1 聚合酶链反应(PCR) 2 核酸杂交(Southern

15、 blot) 3 核苷酸序列分析法:是诊断最可靠和发 现新酶的方法 AmpC酶的检测方法酶的检测方法 方法虽多，但至目前CLSI仍未制定临床筛选AmpC酶的标准，随着产AmpC酶的革兰阴性杆菌引起的耐药性在临床上越来越受到重视，需要建立一种快速、简便的方法常规筛选AmpC酶，任务任重而道远。1 研究AmpC酶的科学意义2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因与表达4 AmpC酶的发展简史5 AmpC酶的检测6 6 产产AmpCAmpC酶菌的治疗与预防酶菌的治疗与预防药物治疗药物治疗给予抗菌治疗后给予抗菌治疗后因为敏感菌株的因为敏感菌株的相继死亡，突变相继死亡，突变菌株被选择出来菌株被选择出

16、来耐药的克隆耐药的克隆在过去曾是在过去曾是敏感的菌落敏感的菌落中生长中生长在治疗过程中在治疗过程中耐药成为临床耐药成为临床表现表现敏感菌落中存敏感菌落中存在着自发的突在着自发的突变菌株变菌株耐药是选择出来的耐药是选择出来的不宜使用第三代头孢不宜使用第三代头孢 三代头孢菌素是AmpC酶的弱诱导剂，但诱导产生的低水平的AmpC酶不足以导致对三代头孢菌素的耐药，而在AmpC基因阳性菌株中使用三代头孢菌素，可能会筛选出高产AmpC酶的耐药株，导致耐药菌流行。因此: 合理使用三代头孢菌素是减少 高产AmpC酶突变株引发耐药的关键。 不应用不应用-内酰胺酶复合制剂内酰胺酶复合制剂v克拉维酸不抑制AmpC酶

17、，反而为强诱导剂;v舒巴坦和三唑巴坦的抑制效果也非常有限；v故-内酰胺酶抑制剂的复合制剂不应用于 治疗高产AmpC酶耐药株感染。第四代头孢菌素第四代头孢菌素v 对AmpC酶亲和力较低（较高的Km值）v 能快速地通过细菌的外膜屏障与PBP结合 头孢吡肟等四代头孢是优先选用的抗生素头孢吡肟等四代头孢是优先选用的抗生素。碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素 亚胺培南，美罗培南等。尽管它们是AmpC酶的强诱导剂，但它们对AmpC酶高度稳定，能在诱导产生足量的AmpC酶之前快速地杀死细菌。同时亦能用于治疗产ESBL肠杆菌属细菌引起的医院感染。 降阶梯治疗降阶梯治疗-严重细菌感染新策略严重细菌感染新策略v第四

18、代头孢菌素有明显的抗菌活性；v碳青霉烯类疗效最好（尤其合并ESBLs时）；v可根据药敏选用氨基糖苷类和喹诺酮类；v不宜使用三代头孢菌素及其复合制剂。高产高产AmpC酶耐药菌的治疗总结酶耐药菌的治疗总结ARPAC(Antibiotic Resistance Prevention And Control)欧洲医院调查欧洲医院调查 FM MacKenzie， Scotland抗菌药使用策略抗菌药使用策略耐药性调查耐药性调查抗菌药使用调查抗菌药使用调查感染控制策略感染控制策略 致力于：少用抗菌药致力于：少用抗菌药 低的耐药率低的耐药率 病原菌的低播散率病原菌的低播散率合理应用抗菌药物，减少选择压力合理应用抗菌药物，减少选择压力 阴沟肠杆菌等可表现为AmpC低水平持续表达，三代头孢菌素是弱诱导剂，ampD基因自发突变率为10-5