免疫共沉淀实验技术

1、免疫共沉淀protocol免疫共沉淀实验技术（IP ）特异性地prorein A 预beads 上的一、原理：IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"结合到免疫球蛋白的FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的先结合固化在argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。1 、实验仪器：高速组织捣碎机：SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E ）电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C ）电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）转印

2、槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）低温高速离心机：Sigma 公司（型号：Sigma 2-16k ）超低温冰箱：SANYO （型号：MDF-382E ）分光光度计：上海尤尼柯（型号：WFZ-UV-2000）脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）2 、主要试剂：HRP 标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）蛋白质预染分子量marker ： FermentasA 蛋白 -sepharose 珠： Pharmacia Biotech 公司产品NC 膜： Millipore 公司（型号：0.45um ）化学发光底物底物：PIERCE公司电泳类生化试剂均为美国am

3、resco 公司产品其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所二、操作流程1 、样品准备1 ）取细胞加入500m上样Buffer（无澳酚蓝）和50ul 10mg/ml PMSF ,混匀，超声 波破碎细胞2 ） 4，12000rpm 离心 10min3 ）取上清夜，- 70冻存24hr5 ） 4 12000rpm 再次离心10min ，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝 （0.1%（W/V） 后于100加热4min ，后于- 20保存待用。2 、定蛋白及计算电泳上样量根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug3

4、、免疫沉淀1 ）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS洗两遍珠子，然后用 PBS配制成50麻度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠2 ）准备 A蛋白-Sepharose 珠.一抗复合物：按每 50 l A 蛋白-Sepharose 珠中加 入 10ul 一抗，4孵育1 h ， 8000rpm 离心 5 min ， PBS 洗涤 3 次，加 50ulPBS3 ）取100 g总蛋白，加入 50ul A 蛋白-Sepharose 珠.一抗复合物，4c轻摇 2h , PBS洗涤3次，之后加入 50ul 1 XSDS凝胶上样缓冲液，100c变性 3 min ,以游离抗原、 抗体

5、、珠子，8000 rpm 室温离心5 min ，蛋白上清储于- 20备用。4 、电泳1 ）安装好电泳装置2 ）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5 体积，液封（10%用异丙醇）3 ） 30min 后，待凝后倾去封液4 ）配5%勺浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子，30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干5 ）上样：各样品取 50ug上样，marker取10（il上样（上样前需按说明书进行预处 理）6 ）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v 电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至 150V 继续电泳7 ）当指示剂距平板底端1cm 处时停止电泳5 、转膜及

6、检测1 ）准备2个12cm的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min ,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min2 ）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min3 ）按顺序安装好转膜装置（黑色板- 海绵 - 三层滤纸- 凝胶 - 硝酸纤维膜- 三层滤纸- 海绵 - 红色板）4 ）完全排除气泡，4，100mA 转膜 2hr 。5 ）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min ，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker 位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右6 ）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭, 4 过夜7 ）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗8 ） 37摇床孵育约2hr9 ） PBST 洗涤 4 次，每次5min10 ）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37摇床孵育约30min11 ） PBST 洗涤 4 次，每次5min12 ）将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物（A 液与 B 液等体积混和），室温孵育5min 后13 ）取出NC膜，去