NaHCO_3胁迫下刚毛柽柳基因表达谱的建立及相关基因的克隆

1、NaHCO_3胁迫下刚毛桎柳基因表达谱的建立及相关基因的克隆刚毛桎柳(Tamarix hispid )为灌木或小乔木,具有强的抗旱、耐盐、耐水 湿、抗沙埋水平,是优良的防风固沙、水土保持和盐碱地造林树种.而且能在含 盐量1 %的盐碱地上形成自然林,为盐碱土指示植物,是进行植物抗盐碱研究的 理想材料.本文研究了刚毛怪柳在盐碱胁迫后不同时间点基因的表达,并克隆出抗逆相关基因.刚毛桎柳在0.4 mol /LNaHCO3胁迫下,分别处理0 h (对照)、24 h和52 h ,以叶片为材料,分别构建了3个仝长cDNA文库.文库的滴度分别为 7.5 X 105 pfu、2.6 X 106pfu、4.0 X

2、 106 pfu ,插入片段平均长度分别为1.1、1.2和1.2 kb ,平均重组率为97.5 %.共获得9447条高质量的ESTs序列,其登录号为 EH048198-EH057644.它们代表了 3945条单一基因序列(Unigene ),包括986个contigs 和2959 个singlets . 3个文库具有的 Unigene分别是1752、1558和1675.将9447条EST序列与GenBank的Nr数据库进行Blastx和Blastn分析,其 中7365条ESTs (占77.96 %)与基因序列相似性高 (E-value 10-4),其余2082 (22.04 %)条相似性低或没

3、有相似性.与基 因序列相似性高的 7365条序列按功能分为 12类,其中光合(photosynthesis ) 占 20.31 %,功能未知(functionunknown )占 13.97 %、细胞防御(Cell rescue )defense )占 13.96 %、能量(Energy)占 7.59 %、蛋白质合成(Protein synthesis ) 占 7.58 %、转运(Transport facilitation )占 7.28 %、转录(Transcription )占 6.63 %、细胞结构(Cell structure )占 6.07 %、代谢(Metabolism )占 5

4、.70 %、蛋白质定位(Protein destination )占 5.02 %、信号转身(Signaltransduction占 3.86 %、细胞生长/分裂( Cell growth , division )占 2.04 %.通过对3个cDNA文库分别进行 EST分析和比拟建立了 NaHCO3 胁迫不同时间点的桎柳基因表达谱,鉴定了大量的盐碱胁迫响应基因.这些基因按功能可以分为：渗透调节、激素信号转导、活性氧去除、转录调控、蛋白合成 和定位、离子平衡、核糖体蛋白、光合作用和代谢等.提示这些途径都可能参与了刚毛桎柳的耐盐碱胁迫.在文库中选择了 9个表达明显差异的基因,利用实时定量( rea

5、l time ) RT-PCR技术,研究比拟了这些 基因在NaCl和NaHCO3胁迫下基因表达模式,发现在 NaCl或 NaHCO3胁迫24 h后这些基因表达趋势比拟相似.但在胁迫52 h后,这些基因对NaCl和NaHCO3胁迫响应表达趋势出现明显差异.文库中含有较多的抗逆相关全长基因,从中选择了液泡膜 H+-ATPase c 、c亚基和 2 个 GRP (glycine-rich RNA-binding protein )基因,对它们在 NaHCO3和NaCl胁迫下基因的表达进一步 的分析.NaCl胁迫后ThVHA cl和ThVHA c 1表达量明显增加, ThGRP1和ThGRP2 基因表达量下降； NaHCO3 胁迫后ThVHA cl和ThVHA c 1的表达量在24 h下降,52 h上升,而ThGRP1和ThGRP2为24 h上升,52 h下降.本 研究发现刚毛桎柳对盐碱胁迫的响应涉及多个生理和代谢途径,并鉴定了一系列胁迫应答基因.这些结果