细胞工程小论文人血清白蛋白融合技木研究进展

1、细胞工程小论文人血清白蛋白融合技术研究进展郑炜，李杰（宜昌人福药业有限责任公司，湖北宜昌443005）摘要：人血清蛋白是血液中含量最丰富的蛋白，它半衰期长，旦具有运输药物的功 能，这是其成为理想的药物我体。作为延长药物半衰期的新技术，白蛋白融合技术是近年 来发展迅速，应用广泛的蛋白质工程技术，通过共价偶联，非共价偶联、纳米包裹和融合 蛋白的方式可实现白蛋白与药物分子的偶联，使药物分子的药代动力学得到明显改善。系 统介绍了白蛋白融合技术的主要方式，进展以及发展方向。随着白蛋白和相关受体蛋白作 用机制的研究不断深入，基于结构的白蛋白融合技术将进一步提高白蛋白融合技术在长效 药物开发中的应用。关键词

2、：人血清蛋白；基因工程；融合蛋白：半衰期正文生物技术产业已经成为全球炙手可热的研究热点，美国NASDAQ的Biotech Index近 十年来增长了一倍。而蛋白质和多肽药物的开发则是生物技术产业的主要研究热点，如凝 血因子、抗体、白介素（Interleukin, IL）、胰岛素（Insulin）、干扰素（Interferon, IFN）、促红细胞生长素（EP0）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）以及各种疫苗等，这些 产品广泛用于医药、食品、保健品、生物材料等众多领域°然而，大多数蛋白和多肽药物 的半衰期很短，一是因为蛋白质药物会被体内的蛋白酶降解而快速清除；二是由F肾小球 的过滤作用

3、使分子量小于60kDa的药物在肾脏代谢中也易被清除。在临床治疗时，为维持 有效血药浓度需要大剂量频繁用药，而长期的反复注射易引发毒副反应，增加病人的痛苦。各种延长药物半衰期的方法相继得到发展和应用，通过增加蛋白分子量以减少肾小球 的滤过作用，通过微球化使药物得到缓释，通过构建抗蛋白酶的突变体减少蛋白酶对药物 的降解，主要技术其中包括：化学修饰、微囊化/纳米粒、构建蛋白能耐受突变体、蛋白 质融合技术。化学修饰、微囊化和构建突变体容易使蛋白和多肽药物活性丧失，并且降 低组织对药物的有效吸收，还极易产生新的抗原表位，引起机体过敏反应；不恰当的蛋白融合也容易使药物分子活性受到影响。因此，开发一种既可保

4、持生物活性，乂无任何副作 用的长效药物技术对提高临床用物的药效十分关键。1人血清白蛋白的融合技术人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）是人体血液中的主要蛋白，该蛋白由 585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为 3454g/L。HSA在调节胶体渗透压、营养和促进伤口愈合等方面起着巨大作用，广泛用于 肝硬化腹水、烧伤、休克等的临床治疗，同时还可作为载体蛋白参与药物在体内的运输功 能（HSA由肝脏合成，血清半衰期很长，可达19天HSA能够与gpl8、gp30、gp60和FeRn 等受体结合，调节HSA的运输和分布。由于-SA具有无免疫原性

5、、人体相容性好、组织 分布广、无酶活等特性，使其成为非常理想药物融合载体。各种基于HSA的药物融合技术 也得到发展和应用，其主要方式主要包括非共价偶联、化学共价偶联、纳米粒子和融合蛋 白等四种形式（如图1所示）（多种针对癌症、肝炎、糖尿病以及心血管疾病的药物都相 继被开发成HSA融合药物，并已进入临床试验阶段（见表1）,有望在近期投入使用。图1人血清蛋白融合技术示意图1. 1非共价偶联技术HSA具有多个药物和脂肪酸的结合位点，在血液中能够结合和运输各种激素、脂肪酸 以及小分子药物，因此小分子药物与HSA的相互结合在药物代谢过程中起着非常重要的作 用°因此，通过增强小分子药物与HSA的

6、相互作用可以达到增强药物半衰期的作用。例如, 诺和诺德公司的Levemir和Victoza两种药物通过与脂肪酸偶联,增强与HSA的结合，使 两种药物的半衰期从几分钟增加到几小时，甚至十几小时；最新开发的Albutag则是一种 能与白蛋白紧密结合的小分子，将抗体与albutag融合可显著增强抗体在体内的半衰期。 同样，能够与HSA紧密结合的蛋白分子也被用于增强药物半衰期，如链球菌G蛋白中的 ABD （Albumin binding Bomains）结构域，该结构域能够与HSA紧密结合，改造后的ABD与白蛋白的亲和力可达飞摩尔级。药物通过与ABD偶联，也能够显著增强其 半衰期，如IFN-2b、Fa

7、b、Nanobody等与ABD融合之后（见表1）,半衰期延长了几十倍, 甚至达到40小时以上，显著增强了药物的有效浓度。表1人血清白蛋白融合蛋白的研究现状1.2共价偶联技术通过化学偶联的方式也可将药物与HSA偶联，主要通过催化人血清白蛋白的赖氨酸残 基（氨基）和半胱氨酸残基（疏基）与药物的共价结合（早期研究将氨甲喋吟 （Methotrexate. MTX）和阿霉素（Doxorubicin, DOXO）通过赖氨酸残基与HSA共价偶联 得到HASTITX和HAS-D0X0。与MTX相比，UTX-HSA的药物半衰期显著延长，而且产生了明 显的肿瘤靶向特性。H期临床实验中，MTX-HSA与顺钳联合治疗

8、膀胱癌，疗效显著，目前 该药物仍处于临床研究中。ConjuChen LIC公司进一步研发了 DAC技术，该技术可将注射 进入体内的多肽药物与血液中的HSA通过Cys34的维基偶联，最终达到增加多肽药物半衰 期和增强药效的目的；最新研制的PC-DAC则是将多肽与重组人血清白蛋白（Recombinant HSA）融合之后用于临床治疗;GLP-1、Ex-endin和insulin均可通过该技术进行修饰（见表D，其中类GLP-1的激动剂CJC-1134-PC未经修饰，体内 半衰期不到lh,通过PC-DAC与HSA偶联后，半衰期增加到8天。1. 3纳米技术HSA纳米药物是以HSA为载体，包裹药物分子，经

9、过固化分离而形成粒径10lOOOnm 的药物释放球体。HAS纳米粒能够降低微粒对巨噬细胞的亲和性，不仅可延长纳米粒半衰 期，还能够提高其靶向性（目前HSA纳米粒主要应用于抗肿瘤药物，American Pharmaceutical公司开发的Abraxane就是以HSA为载体组装而成的紫杉醇纳米药物，传 统的紫杉醇静脉注射药物（Taxol）中含有约50由的乙醵，对人体刺激巨大，用药后还会产 生过敏现象;Abraxane则不会产生此类副作用，可进行正常的静脉注射，临床实验证明其 治疗效果明显好于TaxoL此外，HSA纳米药物也作为造影剂，广泛用于诊断。1.4融合蛋白药物随着基因工程技术的发展，很多蛋

10、白药物都通过基因工程的手段得到，其中包括多肽、 细胞因子、凝血因子、酶、激素!生长因子等。HSA融合蛋白技术即是将药物蛋白的cDNA 和HSA的cDNA偶联，将药物蛋白连接在HSA的C末端或者N末端，产生的融合分子，HSA 融合药物蛋白可在各种宿主中实现高效表达，其中GLP-l、IFN-2b, G-CSP等融合蛋白能 够在酵母中大量表达，表达量可达10g/L以上；抗体!凝血因子等更为复杂的分子可通过 哺乳动物细胞培养得到表达。通过与HSA融合，药物蛋白的半衰期可以得到显著增强。如单独的GLP-1在血液中的 半衰期仅有2分钟，而GLP-1-HSA融合蛋白的半衰期在小鼠体内可达11小时，在食蟹猴

11、体内可达24天；临床实验证明其在人体的半衰期可达5天。而干扰素IFN-2b通过与HSA 融合,半衰期由23小时增加到140159小时;凝血因子FVII和FIX与HSA融合之后, 可保持70%的凝血活性，半衰期延长了 5倍。目前，世界各大制药公司都将HSA融合蛋白技术应用于新药开发。如美国Human Genome Sciences公司利用白蛋白融合技术开发出一系列长效多肽药物，其中包括HAS- IFN-融合蛋白(Albuferon-)、HASTFW (Albuf eron-)、HAS-Ril-2 (Albuleukin)、HAS_Rc_CSF(Albugranin) HAS-HGH(Albutr

12、opin).其中 Albuferon-已经完成临床HI期试验。诺维信公司将抗体SeFv (FITC8)与HSA融合， 开发HSA与抗体的融合蛋白。我国的HSA融合技术处于实验室研究阶段，干扰素、白介素 等分子也相继通过HSA融合的形式在酵母中得到表达，但离商业化生产仍有一段距离。2基于蛋白结构的融合技术改造蛋白在细胞内的代谢与其受体紧密相关，被认为是药物代谢调控的主要因子，如FeRn 受体可与抗体结合，对抗体等药物的半衰期进行调控，HSA的代谢和运输主要通过gpl8、 gp30x gp60和FeRn等蛋白调控，其中gpl8和gp30主要结合构象错误的HSA,并将其清除，但对正确折叠的HSA无任何作用。研究发现， 经过化学修饰，可能导致HSA构象改变，极易被gpl8和gp30清除。而gp60则主要负责 结合构象完好的HSA,将其转运至细胞内，HSA可释放携带的药物分子。除此之外，最新 研究表明FeRn也可结合HSA,并调控HSA的细胞代谢。在酸性条件下，FeRn可通过与 HSA结合，避免HSA被溶酶体降解；碱性条件下，FeRn与HSA解离，将其释放到胞外，维 持了 HSA生理浓度，使其半衰期增长。进一步实验证实，FeRn的亲和力和HSA的半衰期直接相关，不同类型的HSA融合蛋白 与FeRn的亲和力差异明显，而对FeRn亲和力较