利多卡因氯己定气雾剂无菌检查法的验证试验

1、利多卡因氯己定气雾剂无菌检查法的验证试验Validation of sterility test of Lidocaine and Chlorhexdine acetate aerosolHU Wen?hong ， WANG De?li? Shangdong Provincial Institute for Drug Control, Jinan 250101,China【】 ObjectiveThe establishment of Lidocaine and Chlorhexdine acetate aerosol sterility test method?MethodsAccordin

2、g to the 2010 edition of Chinese Pharmacopoeia sterility test method validation testing the requirements, positive test strains by inoculation, add neutralizer removal of Lidocaine on the Chlorhexidine antimicrobial activity of the experimental methods and conditions to verify the establishment of t

3、he sterile checks standard method of operation? ResultsDilution fluid or washing fluid by adding 1% polysorbate 80, the use of membrane filtration, washing each cartridge capacity of 300 ml, Lidocaine and Chlorhexidine can remove the inhibitory effect on bacteria?ConclusionThe method is accurate and

4、 reliable.1 仪器与材料1.1仪器BSC?150(EA2?X生物洁净安全柜；MJ?250l生化培 养箱；GHP?9270隔水式恒温培养箱； SartoriusCP225 d 电子天 平；HTY?2000B集菌仪(杭州泰林医疗器械厂生产)；PY220、PY330 一次性全封闭集菌器 (杭州泰林医疗器械厂生产 )。1.2 培养基营养琼脂培养基 (100409) 、玫瑰红钠琼脂培养 基(090518) 、营养肉汤 (090922) 、改良马丁培养基 (100108) 、 硫 乙醇酸盐培养基 (100323) 均购于北京三药科技开发公司1.3稀释液(冲洗液)pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液

5、购于 北京三药科技开发公司、含1嘛山梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？ 蛋白胨缓冲液 (自配)。1.4 实验用样品利多卡因氯己定气雾剂 ( 规格： 60 g/ 瓶 ) 分 别为山东京卫制药 XX公司(批号：0904008)、济南为民制药XX 公司(批号： 091020)1.5 菌株大肠埃希菌 (Eschrichia coli) CMCC(B)44102、生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B)6494、枯草芽 抱杆菌(Bacillus subtilis) : CMCC(B)63501 、金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B)

6、 26 003 、白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98 001 、黑曲霉 (Aspergillusniger) CMCC(F) 98 003均购于中国生物制品检定所医学菌 种保藏中心，以上菌种均为第 3 代菌种。2 方法与结果2.1 菌液制备 1按中国药典 20 1 0年版二部附录“无 菌检查法”项下方法制成小于 100 cfu/ml 的菌悬液。2.2 验证试验2.2?1 样品的取样量根据 中国药典 2010 年版二部无菌检 查法的有关规定 1，验证试验时每一株验证菌株需要的样品 量相当于每一滤筒的样品量。按此样品的规格： 60 g/ 瓶，取样 量为5瓶/筒，且每瓶

7、取样量不少于1 g/瓶,共5 g，混匀后，备 用。2.2?2 稀释液的选择试验取本品 5 瓶/筒，且每瓶取样量不 少于 1 g/ 瓶,共 5 g ，混匀后，分别转移至 200 ml pH7?0 无菌氯 化钠？蛋白胨缓冲液、含1%聚山梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？蛋 白胨缓冲液作稀释液中，振摇后，取PY220次性全封闭集菌器 （两联）一套，按薄膜过滤法处理，用pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液作冲洗液分别冲洗滤膜 3次，每次 100 ml/ 膜，泵入相同 培养基后，于两筒中分别接入小于 100 cfu/ml 的试验菌。前者 作为阳性对照筒，后者作为试验筒。各试验菌同法操作。再取硫 乙醇酸盐培养

8、基及改良马丁培养基分别泵入另两筒集菌器中， 作 为阴性对照筒。按规定温度将述集菌器培养35 d。其结果见表1。表1 稀释液的选择试验结果稀释液名称培养天数试验菌金葡枯草大肠生孢白念?曲试验对照试验对照试验对照试验对照试验对照试验对照阴性对照硫乙醇酸盐改良马丁 pH7?0 无菌氯化钠 ?蛋白胨缓冲液 1 d?+?+?+2 d?+?+?+3 d?+?+?+ 1%聚山 梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液1 d+2 d+3 d+注+： ?： “无菌生长”； +：“有菌生长”，加号个数表示细菌生长程度2?2?3表1结果表明，用pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液 作稀释液，在规定温度培养后，对金

9、黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌、生孢梭菌均有抑制作用，各试验筒均未有菌生长，阳性对照 筒生长良好； 但对大肠埃希菌、 白色念珠菌和黑曲霉无抑制作用， 试验筒和阳性对照筒均生长良好； 而用含 1%聚山梨酯 80的 pH7?0 无菌氯化钠 ?蛋白胨缓冲液作稀释液，在规定温度培养后，对验 证试验用的 6 种标准菌株均无抑制作用， 各试验筒和阳性对照筒 均生长良好。2?2?4冲洗液的选择试验取本品 5 瓶/筒， 且每瓶取样量不少于1 g/瓶,共5 g,混匀后，转移至200 ml pH7?0 无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液中，振摇后，取PY220次性全封闭集菌器（两联）一套，按薄膜过滤法处理，分别用pH7?0无

10、菌氯化 钠?蛋白胨缓冲液、含 1%聚山梨酯 80的 pH 7?0 无菌氯化钠 ?蛋 白胨缓冲液作冲洗液分别冲洗滤膜 3 次，每次 100 ml/ 膜。以下 操作步骤同前。其结果见表 2。表 2 冲洗液的选择试验结果冲洗液名称培养天数试验菌金葡枯草大肠生孢白念?曲试验对照试验对照试验对照试验对照试验对照试验对照阴性对照硫乙醇酸盐改良马丁 pH7?0 无菌氯化钠 ?蛋白胨缓冲液 1 d?+?+?+2 d?+?+?+3 d?+?+?+ 1%聚山 梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液1 d+2 d+3 d+注+： ?： “无菌生长”； +：“有菌生长”，加号个数表示细菌生长程度2?2?5表 2

11、结果和表 1 结果完全一致。从以上试验结果可知， 把 1%聚山梨酯 80 加在稀释液或冲洗液中作为中和剂来消除药品 的抑菌作用效果是一样的。 两个生产厂家的产品同法操作， 结果 也完全一致。2?2?6 中和剂的验证试验 2证明一种中和剂是否适当主 要基于两点，一是对微生物生长的毒副作用，二是有效性。毒副作用：方法同上。取1%聚山梨酯80的pH7?0无菌氯化 钠?蛋白胨缓冲液 300 ml 滤过集菌器，分别泵入 100 ml 硫乙醇 酸盐培养基和改良马丁培养基，再分别接入小于 100 cfu/ml 的 各试验菌。 按规定温度培养、 观察。 结果见表 3。表 3 结果显示， 用于无菌检查验证试验用

12、的 6 株试验菌株在此条件下均生长良 好。表 3 毒副作用试验结果培养天数1%聚山梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲 液金葡枯草大肠生孢白念 ?曲 1 d+2 d+3 d+注：?：“无菌生长”；+ : “有菌生长”，加号个数表示细菌生长程度有效性：由表1、2中可见，在pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓 冲液中添加 1%聚山梨酯 80，不筒当稀释液还是冲洗液，都能有 效地降低药品的抑菌性，使检验方法简化、便于操作，提高准确 性，符合验证试验要求，可以作为中和剂。3 利多卡因氯己定气雾剂无菌检查方法取本品 15瓶/3 筒，且每瓶取样量不少于 1 g/ 瓶,共 15 g，混匀后，转移至 200

13、ml pH7?0 无菌氯化钠 ?蛋白胨缓冲液 （或含 1%聚山梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液）稀释液中， 振摇，经薄膜过滤法处理，用含 1%聚山梨酯80的pH7?0无菌氯 化钠？蛋白胨缓冲液（或pH7?0无菌氯化钠？蛋白胨缓冲液）作冲 洗液分次冲洗 （ 每膜不少于 300 ml） ，每次 100 ml/ 膜，以金黄色 葡萄球菌为阳性对照菌， 依法检查 （中国药典 201 0年版二部附录 幻H），应符合规定。4 讨论4?1 中和剂的浓度在实验过程中， 笔者还分别对 1%聚山梨酯 80、3%聚山梨酯80、5%聚山梨酯80的pH7?0无菌氯化钠？蛋白 胨缓冲液进行了考察， 试验结果显示， 三个浓度的中和剂均有一 定的中和作用。 但随着浓度的增加， 缓冲液的粘稠度也随之增强， 振摇后，泡沫也随之更加丰富，对滤膜过滤不利。因此，一般情 况下，建议选用1%- 3艦山梨酯80