反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B1和B2的浓度

1、如有你有帮助，请购买下载，谢谢！反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、 B1 和 B 2 的浓度作者：李映章 张志宇 梁晟楠【关键词】 色谱法水溶性维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系，在人体的生命活动中具有十分重要的作用，它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。 目前 VitC ， VitB 1 和 VitB 2 传统测定方法中， VitC 常用 2， 4-二硝基苯肼比色法和 2， 6-二氯靛酚钠盐滴定， 这两个方法灵敏度较低， 特异性差， 目前一般科研项目都不采用这个滴定法;Vit B1 和 Vit B 2 可用荧光法，但该法前期处理操作繁冗，费时费力，其处理方法和过程增加了影响检测

2、精确度欠佳的人为因素。本文数据采用液相色谱法分离检测。1 实验部分1.1 仪器 SY5000LIQUID CHROMATOGR(APBIIEIFN) 具 UV/VIS 检测器，色谱柱：Lichrosphcr C18, 4.6 X250, 5m TL9900色谱数 据工作站。1.2 试剂 本实验所用水为石英亚沸蒸储水，以0.45 m水性 微孔滤膜过滤。 所用试剂均为分析纯( AR) ， 甲醇为一级色谱纯， 标样维生素C、 B 1 、 B 2 贮备液以 0.01mol/L 草酸配制，在4冰箱中保存。VitC临用新配。流动相 A:0.05ml/L KH2 PO4缓冲?取(pH6.00); 流动相B:

3、甲醇。均经0.45"m水性微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用。 整个操作应避光，且操作过程要迅速，以防维生素被氧化。1.3 样品处理 检测学生起床后将昨晚尿排空， 空腹以 200ml 水送服VitC500mg， VitB 1 5mg 和 VitB 2 5mg ，然后收集服药后 4h内排出的尿于1000ml 广口棕色瓶中， 并加 4%的草酸防护，尿液经 0.45wm微孔过滤器过滤 4,超声波脱气后即可上色谱柱分离检测。1.4 色谱仪工作条件色谱检测的流动相由磷酸二氢钾 A 和甲醇B组成，其比例为90： 10和65： 35。流速1.0ml/min ,柱温：室 温，波长:266nm,柱前压：1

4、68240ATM1.5 标准曲线制作配制一系列不同浓度的混合液， 经检测得出的数据作出如下3 种维生素的标准曲线（如图 1 示） 。1.6 色谱检测 分时间段采样， 每采一批样有30 个左右尿样。样品处理后， 按标准样品检测的条件， 以外标法检测 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 ,经TL9900色谱数据工作站处理检测出的数据和图形。2 检测结果经检测，得出样品中所含3 种维生素的量，通过分析可得出如下结果（图 2 为一个样品的 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 3 种维生素的色谱分析图） :色谱法检测得此样品中 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 的峰高分别

5、 为1805mV 40mW 386mV从标准曲线计算出其4h内排出尿样中的 三种维生素的量分别为 2.58mg、0.44mg和0.42mg。从五个斑151个 尿样检测结果来看， VitC 缺乏的占检测总数的15.23%，不足的占13.90%，正常的占70.87%;VitB 1 缺乏的占1.99%，不足的占3.31%，正常的占 94.70%;VitB 2 不足的占16.56%，正常的占52.31%，良好的占31.13%（正常以上的占83.44%） 1 。3 讨论与总结3.1 检测波长的选择 待检测的3种维生素中，VitC在261nmi VitB 1在246nmi VitB 2在260nm波长处有

6、最大的吸收2, 3,本次实验曾分别选用以上 3 种波长检测这三种维生素混合液，以上波 长都不是这3 种维生素混合液的最大吸收波长，经试验，最后确定266nm波长为三种待检测维生素的最佳检测波长。3.2 回收率 测得人体尿样的 3种维生素的含量， 再加入已知浓度的标准品，混合后按1.6 项操作，测其含量，得出其平均回收率的范围是90.12%99.85%,变异系数在1.98%6.56位间，说明此种方法检测人体尿样中的维生素C、 B 1 和 B 2 3 种水溶性维生素的含量是可靠的。3.3 流动相确定流动相由磷酸二氢钾缓冲液和甲醇组成， 本实验曾以不同比例的流动相和波长对3 种维生素C、 B 1 、

7、 B 2 进行反复分离检测。通过实验，最终摸索出检峰形好，保留时间短的流动相组成比例。在磷酸二氢甲缓冲液：甲醇 =90 : 10情况下，VitC保留 时间在 2.280 2.300min 之内，VitB 1 在 5.250 5.400min 之内，VitB 2在20min之后。此种情况分析一个的混合样至少需要 25min （含平 衡时间）。在流动相比例65： 35的情况下，VitB 1保留时间9.120 9.310min 。中 VitC 和 VitB 1 出峰不好，拖尾严重。本实验曾试行以梯度洗脱法检测， 可将 3 种维生素分开， 但检测时间长， 至少在 25min 以上，且出现拖尾情况。考虑

8、到本实验要检测的样品数目多，需以尽快的速度检测，故采取分步检测法：在流动相比例90 ： 10和65 ： 35情况下分别检测 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 ， 两次检测合计不用 20min， 且它们分离得好，波型都是VV波型。3.4 标准样品溶剂的选择在 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 的标准溶液配制中，本实验曾采用盐酸、偏磷酸和草酸作溶剂。从实验情况来看， 草酸是以上3 种维生素较好的溶剂， 其获得检测数据误差小，检测波型好，这可能是草酸对VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 具有更好的稳定作用。3.5 流速 流速对检测精确度影响不大， 但对检测保留时间影

9、响较大。如流速1.0ml/1min ,柱前压稍大一些，在200240ATM之间，但仪器仍然可承受 ; 如果流速变小， 如 0.8ml/min ， 虽然柱前压随之变小，约168atm，但保留时间却延迟510min,这对要检测大量样品是不可取的。故本实验采用 1.0ml/min 流速。3.6 待检样品处理的注意事项 由于维生素类物质稳定性不好， 样品在检测之前， 加入适当的保护剂， 力求低温保存， 防强光照，争取在最短时间内进行检测，以防维生素被氧化。这些都是取得较高检测精确度的重要性举措。3.7 总结 液相色谱法检测快捷，特异性好，灵敏度高 ; 加上仪器具有色谱数据工作站软件，对数据和图形处理极为方便。故该方法是检测维生素物质的理想方法。参考文献1 于守祥， 刘志诚 . 营养与食品卫生监督检测方法指南. 北京 :人民卫生出版社， 1980， 9.2 潘建国，王开发. 高效液相色谱法同步测定花粉中的水溶性维生素 . 上海 : 同济大学出版社