Western_blot的原理、操作及注意事项(经过真实的实验)

1、Western blot 的原理、操作及注意事项 （经过真实的实验）原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针， 对靶物质进行检测， 蛋白质的 Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入 3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入 3 -ME（9.5ml 加入 0

2、.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5 x STOFuffer，收集，180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入 3 -ME（9.5ml 加入 0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例） ：直接收集分泌液，加入3 -ME、溴酚蓝制样。B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1. 双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测

3、定蛋白质浓度的方法。 在需要快速， 但不很准确的测定中， 常用此法。 硫铵不干扰显色， 这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。 双缩脲法的原理是 Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合， 形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。 双缩脲法常用于 0.5g/L 10g/L 含量的蛋白质溶液测定。 干扰物有硫醇， 以及具有 肽性质缓冲液，如 Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。2. Lowry 法：此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu+

4、与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷 -磷钨酸试剂（福林 -酚试剂），结果得到深 蓝色物。 此法比双缩脲法灵敏得多， 适合于测定 20mg/L400mg/L 含量的蛋白质溶液。 其干 扰物质与双缩脲法相同， 而且受他们的影响更大， 硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重 偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。3. 紫外吸收法：大多数蛋白质在280nm波长处

5、有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故， 因此， 利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干 扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定 0.10.5mg/ml含量的蛋白质溶液。 部分纯化 的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：I t in1 rm7" JI mi2他）是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。<ni是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。 此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）他核酸不一定适用

6、。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为得出来的。因此，对其他蛋白质和其0.1%的各0.1%种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.52.5之间变化。所有的蛋白质在 230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽 键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。 从215nm和225nm处的光密度之差可用 于测定浓度为10卩l/ml100卩l/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：a 0.1%在 225nmf rr/八> A len thm蛋航浓原陀心十（£

7、旺光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。4. Bradford 比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5, 10, 15和20卩l ）,以0.15mmol/l NaCI 补足至100 l，同时以两管100 1的0.1

8、5mmol/l NaCI 作空白对照。每管 各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595,取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从 BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100ug的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100g另作一标准曲线进行测定。5 电泳估算法（我们选择此法）：样品倍比稀释，SDS-PAG电泳，同时做定量 marker对照，可以估算样品大概浓度。以提取癌组织总蛋白为例： 取等量胰腺癌组织、 癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗51

9、0次，再用预冷的1 X PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。 每2克组织加入3ml 1 X PBS匀浆，保持在4C条件进行。 加入5X STOFBuffer缓冲液1ml,混匀，4C下超声碎化。再加入0.5ml3 -ME, 0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成； SDS-FAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS- PAGEA:实际操作1.做胶前的准备1）检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。2）检查是否有新鲜的，足量 10%APS没有立刻重配。3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出

10、分离胶各组分 的用量。2.制胶，电泳1）装好架子。2）按照下面配方配制分离胶。（单位：ml. Total : 8ml）7.5%10 %15%2 < Sep. buffer44430 % Gel.sol2.02.74ddH 2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。3）待分离胶凝集后，配制浓缩胶。（单位：ml，Total : 3.5ml）3 %2< Stacking. buffer1.730% Gel.sol0.35ddH 2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入预先准备好的梳子。4）待

11、胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在 1.5小时左右。B :注意事项及常遇到的问题1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2） 上样蛋白量不应超过 30ug/mm （载荷面即：如果你的胶槽是5mn¥ 1mm则载荷面为： 1mm< 5mm=5mm。3 ） gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMEDAPS用量过多，此时胶太硬易龟裂， 而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。4 ）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别

12、是甘油。5 ）电泳中常出现的一些现象：条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。亠 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或 者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBMDDT尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P （0.45um）和 Immob

13、ilon-PSQ（0.2um for MW<20kDa） 。A半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电 流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移 时间短，效率高。1实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2我们通常100mA膜，按照目的蛋白分子大小、 胶浓度选择转移时间, 具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小（kDa）胶浓度转移时间（h）80-1408%1.5-2.025-80101.515-40120.75<20150.52实验操作（1）滤纸和膜的准备（在电泳结束前20分钟应开始准备工作）。A.检

14、查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。C.将膜泡入甲醇中，约 1-2分钟。再转入tran sfer buffer中。D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入tran sfer buffer中（2）转移A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer 到膜上，保持膜的湿润。C. 将胶剥出，去掉stack gel ，小心的移到膜上。D. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶

15、滤纸。F. 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。CATHODE 卜)I靠胶滤纸胶膜靠膜滤纸ANODE (+)3 注意事项及常遇到的问题1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜 >=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须 随时保持湿润（干膜法除外） 。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下 滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为 1.5 小时，

16、（ 1mA-2mA/cm2， 10%gel） ，可根据分子量大小调整转移时间 和电流大小。B 湿法 我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。C 转移后效果的鉴定1染胶用考马斯亮兰染色经 destain 脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2染膜 有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有 ponceau-s red 、 Fastgreen FC、 CPTS 等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料， 如考马斯亮兰、 india ink 、 Amido.black 10B 等，染色后膜就不能用于进一步的分析。四、封闭（ block ）封闭是为了使我们的

17、抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有 bovine serum albumin（BSA） ，non-fat milk ，casein ，gelatin ，tween-20 等，我们一般用 non-fat milk 。在转移结束前配好 5%的 Milk（TBST 溶解） 。转移结束后将膜放入 milk 中 block（ 一定要 放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜 ） ，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使 用。Block 4 ° C O/N,或 RT 1 小时。五、孵育一抗A. 先将需要检测的抗体准备好,并决定好它们的稀释度。B. 配好 5%的 Milk（

18、TBST 溶解 ） ,按要求稀释好抗体。注意,如需高比例稀释, 最好采用梯度稀释。C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用 RT 1 小时,可根据抗体量和膜上 抗原量适当延长或缩短时间。注意：为了便于后面分析结果, 我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作 为 marker 与一抗同时孵育。六、洗涤用TBST先快速洗三次，把 milk尽快的wash掉。然后5mins *5 。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。七、孵育二抗孵育RT1小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低,否则容易导致非特异性的结合。注

19、意二抗的选择有多种, 要根据一抗来选择抗兔、 抗鼠或者抗羊的二抗, 以及根据后面的显色条件来选择 HRP AP或者GO（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核 素等）的。八、洗涤用TBST先快速洗三次，把 milk尽快的wash掉。 然后5mins *5 。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。九、显色（HRF酶）1增强化学发光法（ECL）Ecl显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol , 5Z -氨基-2 , 3-二氢-1 , 4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应 式如下：片

20、十RQ十光鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。试验步骤：1） 将两种显色底物 1: 1等体积混合（一般各 1ml/membra ne ）。2） 将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。4） 在暗室中将 X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。2.DAB显色DAB（ 3,3二氨基联苯胺）和 HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶

21、于酒 精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。对于AP标记的二抗我们选用 BCIP and NBT显色，它们在碱性磷酸酶（ AP）作用下反 应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。十、分析结果及其判断常见问题原因分析及处理方法：见附录一、二。附录一： Troubleshooti ng Blott ing Problems(P43- 48)附录二： Wester n Blotti ng Troubleshooti ng Logic Tree(P390 394)附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1) 5x Stop Solutio n (Sample buffer) pH6.7:Stock:to use:20% Glycerol10% SDS250mM Tris100mltake 9.5ml stock50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml 15.14gbromphe nol blue ortotal475.00mlpyro nine 4 to taste2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):0.8 bis-acrylamide 0.8