实验八质粒DNA的小量制备ppt课件

1、实验八实验八质粒质粒DNA的小量制备的小量制备普通操作步骤：普通操作步骤：培育细菌使质粒扩增培育细菌使质粒扩增搜集和裂解细菌搜集和裂解细菌分别质粒分别质粒DNA碱变性法碱变性法煮沸法煮沸法去污剂法去污剂法有机溶剂法有机溶剂法一、实验目的一、实验目的v掌握碱裂解法提取质粒掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理的原理v熟习碱裂解法提取质粒熟习碱裂解法提取质粒DNA的方法的方法分别质粒分别质粒DNA需求去除的：需求去除的：v大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNAv蛋白质蛋白质vRNA二、实验原理二、实验原理碱变性法抽提质粒的原理碱变性法抽提质粒的原理v碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNA是基于染色体是基于染色体

2、DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的差别而到达分别目的。的变性与复性的差别而到达分别目的。v在在EDTA、溶菌酶和外表活性剂的存在下，经、溶菌酶和外表活性剂的存在下，经碱处置溶菌，碱处置溶菌，v同时在同时在pH高达高达12.012.6 的碱性条件下，染色体的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋构造解开而变性。质粒的氢键断裂，双螺旋构造解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分别。的两条互补链不会完全分别。v当以当以pH4.8的的KAc高盐缓冲液去调理其高盐缓冲液去调理其pH至中性至中性时，变性的质粒时，变

3、性的质粒DNA又恢复原来的构型，保管在又恢复原来的构型，保管在溶液中，而染色体溶液中，而染色体DNA不能复性而构成缠连的网不能复性而构成缠连的网状构造。状构造。v经过离心，染色体经过离心，染色体DNA、不稳定的大分子、不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一同沉淀下来而被除去。复合物等一同沉淀下来而被除去。v降解的小分子降解的小分子RNA可经过可经过Rnase A处置去除处置去除v未除净的蛋白质可经过苯酚未除净的蛋白质可经过苯酚/氯仿抽提除去。氯仿抽提除去。三、实验资料三、实验资料vLB液体培育基、氨苄青霉素液体培育基、氨苄青霉素 v溶液溶液、RNase A 、预冷无水乙醇、预冷无

4、水乙醇 、70%乙醇、乙醇、 TE缓冲液缓冲液vDH5-pCR2.1-Rv1791提质粒用溶液提质粒用溶液、v溶液溶液细菌重悬液：细菌重悬液：v 50mM Tris-HClv 10mM EDTAv pH 7.5v溶液溶液(细菌裂解液：细菌裂解液：v 0.4M NaOHv 2% SDSv溶液溶液:v 1.32M KAcv pH 4.8 (用醋酸调用醋酸调四、实验详细步骤四、实验详细步骤1. 挑取转化平板上的单菌落至挑取转化平板上的单菌落至2ml LB培育液中含培育液中含Amp 100g/ml， 37，250rpm，培育过夜。，培育过夜。2. 取取1.5ml培育物至指形管中，培育物至指形管中，12

5、,000rpm，30s。3. 吸去上清，使沉淀尽能够枯燥。吸去上清，使沉淀尽能够枯燥。4. 将细菌沉淀悬浮于将细菌沉淀悬浮于200l预冷的溶液预冷的溶液中，猛烈振荡。中，猛烈振荡。5. 加加200l溶液溶液新颖配制，盖紧管口，快速颠倒新颖配制，盖紧管口，快速颠倒5次以混匀内容物。冰上放置。次以混匀内容物。冰上放置。6. 参与参与200l溶液溶液冰上预冷，盖紧管口，温暖振冰上预冷，盖紧管口，温暖振荡，冰上放置荡，冰上放置3-5min。7. 4，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管，将上清转移至另一离心管中。中。8. 参与等体积酚参与等体积酚/氯仿氯仿1:1，振荡混匀，振荡混匀，4

6、， 12,000rpm ，2min，将上清转移到另一离心管中。，将上清转移到另一离心管中。(此步也可不做此步也可不做)9. 参与参与2倍体积的无水乙醇，室温静置倍体积的无水乙醇，室温静置2min。10. 4，12,000rpm ，5min。11. 弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 。12. 用用1ml 70%乙醇洗涤质粒乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸沉淀，弃上清，吸干，在空气中枯燥干，在空气中枯燥10min。13. 参与参与30l TE缓冲液含缓冲液含20g/ml RNase A ，不含，不含DNA酶，使酶，使DNA完全溶解。完全溶解。14. 37 ，保温，保温30min，消化，消化RNA，取出置，取出置-20保管。保管。五五.实验结果实验结果v经过凝胶电泳和紫外分光法检测抽提的质粒经过