植物组织培养母液的配制与保存

1、植物组织培养母液的配制与保存目的 熟练掌握植物组织培养中各种成分或成分组的母液（比需要量大若干倍）的配制方法。实验仪器电子天平（感量为 O.OOOIg）、一般天平（感量为 o.1g）、烧杯100mL 50 mL 25mL ）、量筒（1000 mL 100 mL 50 mL ）、容量瓶 200 mL 100 mL 50 mL 25 mL ）、细口瓶（500 mL 200 mL 100 mL 50 mL ）、药勺、玻棒、 电炉等。实验试剂? 按培养基配方准备实验原理一）培养基的组成培养基是植物组织培养中的 “血液 ”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了 解培养基的成分、特点

2、及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用，并且能合 成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分，所以只需在适当 的时候施加少量的无机和有机肥（复合成分），植物就可良好的生长。目前所使用的培养基有1 0余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如， White 培养基是 Uspenski 和 Uspenskaia （ 1925）的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养； Cautheret 培养基是建立在 Knop 营养液 （1865）基础 上的。以后的培养基大部分是在 White 和 Cautheret 培养

3、基的基础上改进而成。 就目前所使用的各种培养基而言，可将它们的成分划分为几大类，常用的有MS 、 B5 、和 White 培养基等。1 水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏 水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究 上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。?2无机营养成分：大量元素，主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种微量元素：培养基的微量元素主要包括铁（卩6）、锰（皿门）、铜（Cu）、锌（乙“）、氯（CI）、硼（B）和钼（Mo ）等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质

4、或酶的生物活性十分重要，有的 是参与某些生物过程的调节。3. 有机营养成分（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等） 维生素：硫氨素（维生素 B1 ）盐酸吡哆醇（维生素 B6）和烟酸 在部分培养基中还添加维生素BX （氨酰苯甲酸）、维生素 C （抗坏血酸）、维生素E （生育酚）、维生素 H （生物素）、维生素 B12 （氰钻胺酸）、维生素BC （叶酸）、维生素 B2 （核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。 氨基酸：甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。 其他：在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、 西红柿汁和酵母浸出物等。这

5、些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇 和磷脂酰肌醇的形式参与由 Ca 介导的信号转导。?4. 碳水化合物 所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。?5. 植物生长调节物质（常称为激素）：生长素类有： NAA （萘乙酸）、 IAA （吲哚乙酸）、 IBA （吲哚丁酸）、 NOA （萘氧乙酸）， P-CPA （对氯苯 氧乙酸）、 2， 4-D（ 2， 4-二氯苯氧乙酸），2， 4，

6、5-T（ 2， 4， 5-三氯苯氧乙酸）等；细胞分裂素类主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素6- （ 4-羟基-3-甲基 -反式 -2-丁烯氨基）嘌呤 。人工合成的细胞分裂素主要有激动素（KT ， 6-呋喃氨基嘌呤）、6-苄基腺嘌呤（ 6-BA ）、2IP （异戊烯氨基嘌吟）和 TDZ （thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调 节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成；赤霉素：主要是 GA3 ，虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为 它的作用往往是负面的；乙烯等。6. 琼脂或其他支持物除液体悬浮培养外

7、，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度 0.4%-1% ，质量越差的琼脂 用量越大。?7. 其他添加剂（含天然提取物、抗生素等）? 活性炭 渗透调节剂 ? 抗生素 抗氧化剂等二）培养基的选择选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本 培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。 MS 培养基适合于大多数双子叶植物， B5 和 N6 培养基适合与许多 单子叶植物，特别是 N6 培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White 培养基适合于根的培养。实验内容与步骤一）MS 大量元素母液的配制一般将大量元素分别配制成 10倍的母液，使用时再分

8、别稀释 10 倍。 依次分别称取：? ? ? NH4NO3 ? ? ? ? 16.5g ? ? ? ? ? ? ? KNO3 ? ? ? ? ? 19.0g ? ? ? ? ? ?KH2PO4 ? ? ? ? 1.70gMgSO4- 7H2O ? ? 3.7gCaCI2 2H2O ? ? 4.4g共配成 1L 的母液。倒入 1L 试剂瓶中，存放于冰箱中。二）MS 微量元素母液的配制一般将微量元素配制成 100 倍母液。依次称取：KI ? ? ? ? ? ? ? ? 0.083g ? ? ? ?Na2MoO4- 2H2O ? ? ? 0.025gH3BO3 ? ? ? ? ? ? 0.62g ?

9、 ? ? ?CuSO4-5H2O ? ? ? ? 0.0025gMnSO4- H2O ? ? ? 1.69g ? ? ? ? ?CoCI2 6H2O ? ? ? ? 0.0025gZnSO4 7H2O ? ? ? 0.86g配成 1L 母液，倒入 1L 试剂瓶中，存放于冰箱中。CuSO4 5H2O 和 CoCI2 6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取CuSO4 5H2O ? ? ? ? 0.05g ? ? ? ? CoCI2 6H2O ? ? 0.05g各自配成 100mI 的调整液，然后取 5mI 就还有 0.0025g 的量。三）MS 有机质

10、母液的配制? ? ? 一般配制成 100 倍 MS 有机母液。依次称取肌醇 ? 10g ? ? ? ? 盐酸硫胺素（ VB1 ）0.01g烟酸? 0.05g ? ? ?甘氨酸? ? ? 0.2g盐酸吡哆醇（VB6 ）? ? 0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。四）MS铁盐母液的配制一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取：EDTA二钠3.73g和FeS04 7H2O 2.78g，配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。?所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、 MS有机母液和 MS铁盐母液，共8种母液。五）几种生长调节物质的配制?各种生长素和细胞分裂素要

11、单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用 1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。?母液的保存：一般将以上配制好的各种母液保存在4C左右冰箱内。注意事项1. ? ? ?称量要精确2. ? ? ?配制母液时要注意药品溶解的先后顺序，以免发生化学反应，使的产生沉淀。附：MS培养基母液的配制与保存仪器与用具1、仪器：各类天平、磁力搅拌器、冰箱等。2、用具：烧杯、容量瓶、量筒、试剂瓶、标签等。3、 试剂：95%酒精，0.1-1 NaOH，0.1-1NHCI，配制MS培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。

12、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10100倍的溶液。优点：（1）保证各物质成分的准确性。（2）便于配置时快速移取。（3）便于低温保藏。1、MS大量元素母液（10X ）称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液 100ml化学药品1升量10升量NH4NO31650 mg/L16. 5gKNO31900 mg/L19. 0gCaCI2 -2H2O440 mg/L4. 4gMgSO4 7H2O370 mg/L3. 7gKH2PO4170 mg/L1. 7g2、MS微量元素母液（100X ）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液 10ml化

13、学药品1升量10升量MnSO4 4H2O22. 3 mg/L223mg1(MnSO4 H2O)(21 . 4 mg/L )ZnSO4- 7H2O8. 6 mg/L86mgCoCl2-6H2O0. 025mg/L0. 25mgCuSO4 5H2O0. 025 mg/L0. 25mgNa2MoO4 2H2O0. 25 mg/L2. 5mgKI0. 83 mg/L8. 3 mgH3BO36. 2 mg/L62 mg注意：CoCI26H2O 和 CuS04 5H2O 可按 10 倍量（0. 25 mgX10=2 . 5 mg）或 100 倍量（25 mg）称取后，定 容于100ml水中，每次取 10m

14、l或1ml ,（即含0. 25 mg的量），加入到母液中。3、MS铁盐母液（100X ）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液 10ml化学药品1升量10升量Na2 -EDTA37 . 3 mg/L373 mgFeSO4 -7H2O27 . 8 mg/L278 mg注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。混合时,先取一种置容量瓶 （烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕 色试剂瓶中。4、MS有机物母液（100X ） 称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液 10ml。化学药品1

15、升量10升量烟酸0. 5 mg/L5mg盐酸吡哆素（VB6 ）0. 5 mg/L5mg盐酸硫胺素（VB1 ）肌醇100 mg/L1 g甘氨酸2 mg/L20mg5、生长调节剂单独配制，浓度为 1-5 mg/ml （书中为 0. 5 -1mg/ml ），一般配成 4 mg/ml。配制培养基母液时注意事项： 一些离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶解，在按配方顺序依次混合； 配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水； 药品应用化学纯或分析纯； 溶解生长素时，可用少量0. 5 -N的NaOH或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0. 5 -N的HCl加热溶解。（二）母液的保存1、装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中

16、，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。注意 将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。2、贮藏：4C冰箱。附：组织培养室操作程序一.生产环境1. 工作人员进入组培室必须穿工作服，包括更换拖鞋、穿白大褂，接种人员还要带帽、带口罩。2. 所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹。3 工作期间，各生产房间要关闭房门，尤其是接种间；工作人员出入要随手关门。4 各种生产用品要安固定的位置排放整齐，不可乱拿乱放。5 工作过程中所产生的垃圾要及时清理，尤其是接种间，其内垃圾停留时间不得超过4 小时。二 . 接种程序1. 准备工作：接种人员在正式接种之前要做好准备工作，包括准备酒精灯、新洁尔灭、灭菌用

17、脱脂棉 以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等。2.3. 酒精灯用工业酒精作燃料，而非75%酉精。4.4. 工作台上用的新洁尔灭浓度是 0.1%，而非0.01%。6.5. 工作台灭菌包括两步：一是上台前用紫外灯照射30 分钟，二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。8.9.培养皿的取放：从布包里取培养皿时，一定要注意，手不能接触培养皿的边沿，同时要尽可能减少与培养皿的接触面，一般规定只能用双手的拇指和食指取放。接种工具灭菌也分两步，一是用灭菌布包裹好，在高压锅里灭一次，这一步由灭菌人员负责 完成；二是在工作台上，从布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放在酒精灯火焰上灼烤一遍，其要 求

18、是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于 5秒钟。在工具灭菌之前，工作人员的手部，包括手腕， 都要用酒精仔细擦拭一遍。2 接（转）苗：包括取苗、切苗和接苗三步。取苗：先解开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要先把封口膜（瓶盖）口对者风源放在酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤710秒；正式取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。切苗：培养皿放在离风窗 10 20 厘米处，不可太往外；镊子和手术刀都不可太热，最好是凉 的，且在操作过程中，刀和镊都要培养皿斜上方操作，不可在其正上方操作；在切苗过程中产生的垃 圾可堆放在培养皿内的一侧位置上，若非迫不得已，不可弄到培养皿外。接苗：培养瓶盖（或封口膜）的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同，烤完瓶口后，要先 倒掉瓶内多余的水分，然后在接苗；接苗时，镊子最好不要与瓶口接触，一瓶内一般接5 6