基因工程菌苗研究的现状与发展

1、 第六章第六章 基因工程菌苗研究的现状与发展基因工程菌苗研究的现状与发展（Status and development of gene engineering bacteria vaccine） 第一节第一节 概述概述（Section I outline）1883年年-1885年巴斯德（年巴斯德（Pasteur）用理化和生物学方法制备了减）用理化和生物学方法制备了减毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。19世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效果可达比较成功的是破伤风、

2、白喉类毒素疫苗的应用，其效果可达95%以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降。病死率大幅下降。 细菌一旦获得耐药性，存在与细菌染色细菌一旦获得耐药性，存在与细菌染色体、质粒和转座子中的耐药基因就可通过体、质粒和转座子中的耐药基因就可通过转化、转导、接合和转座等方式，将抗性转化、转导、接合和转座等方式，将抗性基因传播到其他敏感菌，使之成为抗药菌基因传播到其他敏感菌，使之成为抗药菌株，给临床传染病的治

3、疗带来困难。据株，给临床传染病的治疗带来困难。据WHO1996年报告，全球每年死亡约年报告，全球每年死亡约5190万人，其中万人，其中1/3约约1730万死于传染病。万死于传染病。在过去在过去20年中，有年中，有29种新传染病出现种新传染病出现。 美 国。 美 国 S a t c h e r 博 士 在博 士 在 E m e r g i n g Infectious Diseases杂志创刊刊号列出自杂志创刊刊号列出自1973年以来鉴定的主要传染病或病原体年以来鉴定的主要传染病或病原体22种。近年鉴定的新病原体和疾病鉴定种。近年鉴定的新病原体和疾病鉴定年份依次列于表年份依次列于表6-1。表表6

4、-1 6-1 新鉴定的病原体新鉴定的病原体 年份年份病原体病原体所致疾病所致疾病1975微小病毒微小病毒B19（pawovirus B19）5号病，慢性溶血性贫血号病，慢性溶血性贫血中的再障危象中的再障危象1976隐孢子虫（隐孢子虫（cryptosporidium）隐孢子虫病，急性小肠隐孢子虫病，急性小肠结肠炎结肠炎1977埃博拉病毒（埃博拉病毒（ebolavirus）埃博拉出血热埃博拉出血热1977军团病杆菌（军团病杆菌（legionellapneumophila）军团病军团病1977汉坦病毒（汉坦病毒（hantsann virus）肾综合症出血热肾综合症出血热1977弯曲杆菌（弯曲杆菌（c

5、ampylobacter）空肠弯曲杆菌肠炎空肠弯曲杆菌肠炎1980人嗜人嗜T淋巴细胞病毒（淋巴细胞病毒（HTLV-1）T细胞淋巴瘤白血病细胞淋巴瘤白血病1981葡萄球菌毒素（葡萄球菌毒素（toxin producing aureus） 中毒性休克综合症中毒性休克综合症 1982 大肠杆菌大肠杆菌O157：H7（E.coli O157:H7） 出血性肠炎，溶血性尿出血性肠炎，溶血性尿毒综合症毒综合症 1982 HTLV-II 毛皮样细胞白血病毛皮样细胞白血病 1982 伯氏疏螺旋体（伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi） 莱姆病莱姆病 1983HIV艾滋病艾滋病1983幽门螺杆

6、菌（幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）胃溃疡胃溃疡1988人疱疹病毒人疱疹病毒6型（型（HHV-6）突发性玫瑰疹突发性玫瑰疹1989查菲氏欧利希氏体查菲氏欧利希氏体人欧利希氏病人欧利希氏病1989丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（hepatitis C）丙型肝炎丙型肝炎1990 戊戊 型肝炎病毒（型肝炎病毒（hepatitis E） 戊型肝炎戊型肝炎1991Guonarito病毒病毒委内瑞拉出血热委内瑞拉出血热1992霍乱弧菌霍乱弧菌O139地方性流行性霍乱地方性流行性霍乱1992巴尔道氏体（巴尔道氏体（Bartonella henselae）猫抓病、细菌性血管瘤病猫抓病、细菌性血

7、管瘤病1992环形孢子环形孢子环形孢子虫病环形孢子虫病1993汉坦病毒分离株汉坦病毒分离株汉坦病毒综合症汉坦病毒综合症1993Sin nombre virus1994 Sabia病毒病毒 巴西出血热巴西出血热 1995庚型肝炎病毒（庚型肝炎病毒（hepatitis G）庚型肝炎庚型肝炎1995人疱疹病毒人疱疹病毒8型（型（HHV-8）卡波济肉瘤，淋巴瘤卡波济肉瘤，淋巴瘤1996朊病毒（朊病毒（prion）(BSE,TSE)传染性海绵状脑病，克雅病传染性海绵状脑病，克雅病1997TT病毒（病毒（TT Virus）TTV肝炎肝炎1999尼巴病毒（尼巴病毒（nipah virus）发热性脑炎发热性脑

8、炎1999伊氏埃立克体（伊氏埃立克体（Ehrlichia ewingii）人埃立克体病人埃立克体病 新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继开始。开始。重要病原体全基因测序的开展和完成，及类似生重要病原体全基因测序的开展和完成，及类似生物表型的不同菌属间的同源序列和异源序列的发现物表型的不同菌属间的同源序列和异源序列的发现，对抗感染研究来说，像进行了一场革命，不仅会，对抗感染研究来说，像进行了一场革命，不仅会促进病原体致病和发病机制的研究，也会开阔和调促进病原体致病和发病机制的研究，也会开阔和调整菌苗研究的策略和思路。整菌苗研究的策略和思路。目前已完

9、成目前已完成500500余种病毒的全基因测序，关于重要余种病毒的全基因测序，关于重要病原菌全基因测序进展情况列于表病原菌全基因测序进展情况列于表6-26-2。 完成的完成的正在进行的正在进行的将要进行的将要进行的流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）放线性放线菌放线性放线菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）弯曲杆菌（弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）生殖道支原体生殖道支原体（Mycoplasma genitolium）枸巢曲霉杆菌（枸巢曲霉杆菌（Aspergillus midulans）流产布氏杆菌（

10、流产布氏杆菌（Brucella abortus）肺炎支原体肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）枯草杆菌（枯草杆菌（Bacillus subtilis）杜克雷嗜血杆菌（杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）幽门螺杆菌幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）沙眼衣原体（沙眼衣原体（Chlamydia trachomatio） 鸟分枝杆菌（鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium） 伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi） 粪肠球菌（粪肠球菌（Enterococcus faecalis, E.faecium） 多

11、杀巴斯德菌（多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida） 表表6-2 6-2 人类重要病原菌全基因测序现状人类重要病原菌全基因测序现状 E.coli K12军团菌（军团菌（Legionella pneumopbila）牙龈卟啉单胞菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingvalis）肺炎球菌肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）麻风分枝杆菌（麻风分枝杆菌（Mycobacterun leprae）鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella serotype Typhimurium）梅毒螺旋体梅毒螺旋体（Treponeme pallidun）

12、淋病脑膜炎奈瑟氏球菌淋病脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis）布氏锥虫布氏锥虫（Trypanosoma brucei） 解脲原体解脲原体（Ureoplasma urealyticum）亚性疟（亚性疟（plasmodium falciparum）痢疾杆菌痢疾杆菌（Shigella） 绿脓杆菌（绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa） 大型利什曼原虫大型利什曼原虫（Leishmania major） 金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 霍乱弧菌（霍乱弧菌（Vibrio cholera

13、e） 化脓链球菌（化脓链球菌（Streptococcus pyogenes） 总之，已控制传染病的再现及新传总之，已控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意，对染病的出现，已引起全球的注意，对传染病威胁需要再认识，已有共识。传染病威胁需要再认识，已有共识。因此，有必要加快进行创新性的细菌因此，有必要加快进行创新性的细菌菌苗的研制与开发。菌苗的研制与开发。 第二节第二节 目前应用的菌苗及其存在问题目前应用的菌苗及其存在问题 Present bacteria vaccine and the question一、目前应用菌苗的类别一、目前应用菌苗的类别The type of bacteri

14、a vaccine 按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即减毒减毒的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与核酸菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合菌苗蛋白结合菌苗。 1、减毒的活菌苗（、减毒的活菌苗（Attenuated bacteria vaccine）如卡介苗（如卡介苗（BCG），是巴斯德研究院），是巴斯德研究院Calmette和和Guerin等（等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘油）将

15、一株牛型强毒结核菌在甘油-胆胆汁汁-马铃薯培养基上传马铃薯培养基上传230代后（代后（13年），获得的对动年），获得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即BCG。对免疫婴幼儿有保护效果。对免疫婴幼儿有保护效果。后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行比较，方知比较，方知BCG缺失了毒力相关基因。缺失了毒力相关基因。总之，对

16、胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。 2、灭活菌苗、灭活菌苗 （Dead bacteria vaccine）通过加热处理或福尔马林（通过加热处理或福尔马林（formaldehyde）、戊二醛（、戊二醛（glutaraldehyde）、）、-内酯（内酯（-propiolactone）等化学处理得到。如霍乱死菌）等化学处理得到。如霍乱死菌苗、百日咳（苗、百日咳（Bordetella pertussis）死菌苗等。）死菌苗等。死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次免疫才能得到好的保护效果。免疫才能得到好的保护效果。 3 3、亚单位

17、或成分苗、亚单位或成分苗 （Subunit bacteria vaccine） 从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的类类毒素苗毒素苗，如破伤风类毒素（，如破伤风类毒素（TTTT）、白喉类毒素）、白喉类毒素（DTDT），免疫后诱导机体产生的抗血清能特异），免疫后诱导机体产生的抗血清能特异中和中和TTTT破伤风类毒素或破伤风类毒素或DTDT白喉类毒素，其保护白喉类毒素，其保护效果可达效果可达95%95%以上。由于毒素纯化方法的改进，以上。由于毒素纯化方法的改进，产品的副作用很小。产品的副作用很小。 荚膜细菌纯化的荚膜细菌纯化的多糖菌苗多糖菌苗，可诱导产生的抗体，

18、可诱导产生的抗体能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流感杆菌感杆菌b（Hib）、伤寒杆菌）、伤寒杆菌Vi多糖等多糖苗，能多糖等多糖苗，能诱导机体产生诱导机体产生T细胞非依赖的抗体反应，其特点细胞非依赖的抗体反应，其特点是诱导产生短期的是诱导产生短期的IgM抗体，缺乏免疫记忆，对抗体，缺乏免疫记忆，对不到不到18个月幼儿的多糖苗免疫原性差，而没有保个月幼儿的多糖苗免疫原性差，而没有保护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。 表表6-3 6-3 目前可用于人群的菌苗目前可用于人群的菌苗 菌苗菌苗 类型类型预防的疾病预防的疾病

19、 国内国内 国外国外 1 卡介苗（卡介苗（BCG）活菌苗活菌苗结核病结核病i.di.d2布氏病菌苗布氏病菌苗（104M）活菌苗活菌苗布氏菌病布氏菌病d.s3 鼠疫菌苗（鼠疫菌苗（EV）活菌苗活菌苗鼠疫鼠疫d.s4 炭疽菌苗炭疽菌苗（A16R,CTN-1,V770-NP-1） 活芽胞苗活芽胞苗 炭疽炭疽 d.s 炭疽菌苗炭疽菌苗 灭活菌苗灭活菌苗 炭疽炭疽 s.c 菌苗菌苗 类型类型预防的疾病预防的疾病 国内国内国外国外 5 百日咳菌苗百日咳菌苗 类毒素类毒素 灭活菌苗灭活菌苗 百日咳百日咳 炭疽炭疽 i.m i.m 6脑膜炎球菌苗（脑膜炎球菌苗（A、C群）群） 多糖成分多糖成分 脑膜炎脑膜炎

20、i.m s.c 7脑膜炎球菌苗脑膜炎球菌苗（A/C/Y/W-35群）群） 多糖成分多糖成分 脑膜炎脑膜炎 s.c 8流脑流脑A群多糖群多糖-破伤风破伤风蛋白结合菌蛋白结合菌 苗苗多糖多糖-蛋白结蛋白结合苗合苗 流行性脑脊流行性脑脊髓膜炎髓膜炎 i.m 9伤寒菌苗（伤寒菌苗（Ty21a） 伤寒菌苗（伤寒菌苗（Ty21a）伤寒伤寒Vi多糖苗多糖苗 活菌苗活菌苗 灭活全菌苗灭活全菌苗 多糖成分多糖成分 伤寒伤寒 伤寒伤寒 伤寒伤寒 i.m p.o s.c i.m 10精制破伤风菌苗精制破伤风菌苗 类毒素类毒素 破伤风破伤风i.m i.m 11精制白喉菌苗精制白喉菌苗 类毒素类毒素 白喉白喉 i.m

21、菌苗菌苗 类型类型预防的疾病预防的疾病 国内国内国外国外 12 白白-百百-破三联苗破三联苗（DTP） 类毒素类毒素 白喉，百日咳白喉，百日咳 i.m 灭活全苗灭活全苗 破伤风破伤风 i.m 13 白白-破破-百三联（百三联（DTaP） 类毒素类毒素 白喉，百日咳白喉，百日咳 i.m 白白-破破-百三联苗百三联苗 灭活全苗灭活全苗 破伤风破伤风 i.m 14 白白-破二联苗（破二联苗（DT或或Td） 类毒素类毒素 白喉，破伤风白喉，破伤风 i.m i.m 15 钩端螺旋体菌苗钩端螺旋体菌苗 外膜成苗外膜成苗 钩端螺旋体病钩端螺旋体病 s.c 16 霍乱弧菌（霍乱弧菌（O139） 灭活全菌灭活全

22、菌苗苗 霍乱霍乱 s.c S,c/i.d 17 CVD103HgR 基因工程基因工程活苗活苗 霍乱霍乱 p.o 18 肺炎球菌（肺炎球菌（23型）型） 多糖成分多糖成分 肺炎肺炎 p.o 菌苗菌苗 类型类型预防的疾病预防的疾病 国内国内国外国外 19嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌B型型（Hib）类毒素类毒素脑膜炎脑膜炎i.m20 DTP-嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌B型结合苗型结合苗灭活的全菌灭活的全菌苗苗白喉，百日白喉，百日咳，咳，i.m（DTP-Hib）细菌多糖细菌多糖-蛋蛋白结合菌苗白结合菌苗破伤风，脑破伤风，脑膜炎膜炎i.m21 福氏福氏2a与宋内双价痢与宋内双价痢疾菌苗（疾菌苗（FSM2117

23、）基因工程活基因工程活苗苗痢疾痢疾p.oF2a与宋内双价痢疾与宋内双价痢疾菌苗（菌苗（FS）基因工程活基因工程活苗苗痢疾痢疾p.o 22 莱姆病菌苗（莱姆病菌苗（OspA）重组重组OspA莱姆病莱姆病s.c注：注：i.d皮内，皮内，s.c皮下，皮下，d.s划痕，划痕，i.m肌注，肌注，p.o口服口服 （二）研制菌苗的新方法（二）研制菌苗的新方法（New method of produce bacteria vaccine）1 1、研制菌苗的新方法（、研制菌苗的新方法（new methods）对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒力决定簇如粘

24、附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不断设计和研制新型疫苗的重要基础。断设计和研制新型疫苗的重要基础。针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型的菌苗。和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型的菌苗。目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表6-4 6-4 。表表6-4 目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗目前研制菌苗的新方法及

25、可能的候选菌苗 1 纯化亚纯化亚单位成单位成份份嗜血流感杆菌（荚膜多糖）（嗜血流感杆菌（荚膜多糖）（H.influenze）奈氏脑膜炎球菌（荚膜多糖）奈氏脑膜炎球菌（荚膜多糖）（N.meningitidia）百日咳菌血凝素（百日咳菌血凝素（Hemagglutinin）2 合成肽合成肽 淋球菌（黏附菌毛）淋球菌（黏附菌毛）（N.gonorihoeae,Adhernce-pili）肺炎链球菌（肺炎链球菌（Streptococcus）3核酸疫核酸疫苗苗结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（M.tuberculosis）产单核细胞李斯特菌（产单核细胞李斯特菌（L.monocytogenes）沙眼衣原体（沙眼衣原

26、体（Chlamydia trachomatio）伯氏疏螺旋体（伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）4构建突变株构建突变株（化学、辐射、点突变（化学、辐射、点突变或转座子插入等）或转座子插入等）伤寒菌苗伤寒菌苗Ty21a（S. typhi,Ty21a）霍乱菌苗（霍乱菌苗（V.Cholerae）CVD103HgRETEC苗苗5与与CT-B，LT，TT，DT等化学结合等化学结合 伤寒伤寒Vi抗原抗原痢疾菌苗痢疾菌苗,嗜血流感杆菌苗嗜血流感杆菌苗6构建重组细菌载体构建重组细菌载体 重组病毒载体重组病毒载体HbsAg肠沙门氏菌载体肠沙门氏菌载体宋内氏痢疾菌宋内氏痢疾菌LPS痢疾菌载体

27、痢疾菌载体痢疾多价菌苗痢疾多价菌苗耶尔森氏菌载体耶尔森氏菌载体 BCG载体载体幽门螺杆菌溶酶素幽门螺杆菌溶酶素腺病毒载体腺病毒载体霍乱菌载体霍乱菌载体2、目前菌苗存在的问题（、目前菌苗存在的问题（questions）（1）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，但小于但小于5岁的婴幼儿每年死于传染病的数岁的婴幼儿每年死于传染病的数目仍然很高。目仍然很高。如疟疾几种腹泻病等均无有如疟疾几种腹泻病等均无有效疫苗，虽然卡介苗（效疫苗，虽然卡介苗（BCG）使用几十）使用几十年了，甚至纳入年了，甚至纳入WHO的计划免疫，但其的计划免疫，但其效果波动很大效果波动很大0%80%，因此急

28、需安全有，因此急需安全有效的结核菌苗问世。效的结核菌苗问世。 （2 2）与病毒相比）与病毒相比：基因工程细菌及细菌核酸苗报导明显少。至今国际基因工程细菌及细菌核酸苗报导明显少。至今国际上还没有成功满意的重组细菌苗提供人群使用。关于上还没有成功满意的重组细菌苗提供人群使用。关于细菌毒素的分子及其编码基因与调控机制都比较清楚细菌毒素的分子及其编码基因与调控机制都比较清楚，因此，有关毒素的基因工程菌苗的构建或载体构建，因此，有关毒素的基因工程菌苗的构建或载体构建等均无问题。等均无问题。但菌外膜上的其它结构如粘附分子，侵袭蛋白，鞭但菌外膜上的其它结构如粘附分子，侵袭蛋白，鞭毛及脂多糖等分子结构十分复杂

29、，编码基因多呈丛分毛及脂多糖等分子结构十分复杂，编码基因多呈丛分布，如布，如LPSLPS的表达涉及近的表达涉及近3030个基因的级联反应，操作起个基因的级联反应，操作起来尚有困难。因此还有毒力相关或保护相关基因的分来尚有困难。因此还有毒力相关或保护相关基因的分离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做（三）理想菌苗的条件（三）理想菌苗的条件（Ideal bacteria vaccines condition）理想疫苗应该是：理想疫苗应该是：（1 1）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌性，无致畸变或致流产性。性

30、，无致畸变或致流产性。（2 2）结构简单清楚，可生物降解，有生物相）结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。（3 3）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。（4 4）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。（5 5）能口服，能有效诱导粘膜免疫。）能口服，能有效诱导粘膜免疫。（6 6）易于生产，储存及服务，不需冷藏。）易于生产，储存及服务，不需冷藏。 每一项要求，都需要大量的基础研究，已能提每一项要求，都需要大量的基础研究，已能提出更为合理的疫苗研究策略

31、，研制出安全高效，使出更为合理的疫苗研究策略，研制出安全高效，使用方便，价格低廉的菌苗用方便，价格低廉的菌苗 第三节第三节 重要细菌基因工程苗的研究进展重要细菌基因工程苗的研究进展（Development of important gene engineering bacteria vaccine) 当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重要细菌感染性疾病的问题有：要细菌感染性疾病的问题有：现有菌苗保护效果不好；现有菌苗保护效果不好；副反应大；副反应大；难以培养的细菌；难以培养的细菌；可诱发癌变，有严重后遗症；可诱发癌变，有严重后遗症；新出现的病原体或新

32、变异病原菌。新出现的病原体或新变异病原菌。一、霍乱菌苗一、霍乱菌苗 ( (Cholera vaccine) )霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CTCT）引起腹泻及其他症状。）引起腹泻及其他症状。已知有已知有O O抗原，毒素共调节菌毛（抗原，毒素共调节菌毛（TCPTCP），血凝素（），血凝素（HAHA），外），外膜蛋白（膜蛋白（OMPsOMPs）等，及引起水样腹泻的霍乱毒素（）等，及引起水样腹泻的霍乱毒素（CTCT）由）由AB5AB5的六聚体构成。的六聚体构成。霍 乱 产 毒 株霍 乱

33、 产 毒 株 c t x A Bc t x A B 的的 5 5 端 有 一端 有 一 6 k b6 k b 的的 D N AD N A ， 依 次 有， 依 次 有20t,ace,orfu,cep20t,ace,orfu,cep和和RSRS序列与序列与ctxABctxAB一起称为霍乱毒素元件（一起称为霍乱毒素元件（CTXCTX）元件，可进行转移，与一种丝状噬菌体（）元件，可进行转移，与一种丝状噬菌体（CTXCTX）有关，）有关，而非产毒株没有这段而非产毒株没有这段DNA DNA 。据菌体抗原霍乱弧菌可分为据菌体抗原霍乱弧菌可分为200200个以上的血清型个以上的血清型1881-1896188

34、1-1896年间的年间的5 5次及次及1899-19231899-1923年的第年的第6 6次大次大流行均由流行均由O1O1群古典型霍乱弧菌引起。群古典型霍乱弧菌引起。第第7 7次大流行自次大流行自19611961年延续至今，波及五大洲年延续至今，波及五大洲19921992年出现了一新的流行株年出现了一新的流行株O139O139血清型霍乱血清型霍乱目前流行的霍乱为目前流行的霍乱为O1O1和和O139O139两种血清型。两种血清型。近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：近十年来研制的新霍乱菌苗有四类： 1.1.BS/WC灭活菌苗灭活菌苗( (BS/WC dead bacteria vaccine ）

35、由提取的或重组的霍乱毒素由提取的或重组的霍乱毒素B B亚单位（亚单位（BSBS）及杀死的全）及杀死的全菌细胞（菌细胞（WCWC）组成。）组成。2.2.CVD103-HgR减毒活菌苗（减毒活菌苗（Levine 1998） 在美国获准，为一次剂量的霍乱活菌苗。它是由霍乱在美国获准，为一次剂量的霍乱活菌苗。它是由霍乱经典型经典型569B569B菌株构建而成的菌株构建而成的CVD103CVD103减毒株（减毒株（CTACTA- -B B+ +）。并）。并在其染色体溶血素基因在其染色体溶血素基因nlyAnlyA位点插入汞抗性基因作为筛选位点插入汞抗性基因作为筛选标记。标记。3.3.以沙门氏菌为载体表达霍

36、乱弧菌以沙门氏菌为载体表达霍乱弧菌O O抗原的伤寒抗原的伤寒/ /霍乱双价霍乱双价菌苗。菌苗。4.4.O139减毒菌苗候选株减毒菌苗候选株CVD112及及Bengal-15 表表6-5 6-5 重组霍乱菌苗的特性重组霍乱菌苗的特性 菌菌苗苗株株亲株（生亲株（生物型，血物型，血清型）清型）特性特性口服口服副反副反应应a a定居率定居率（% %）b b保护率保护率（% %）c c攻击苗攻击苗排菌率排菌率（% %）d d作者作者JBJBK7K70 0NI NI 6961(E1T6961(E1Tor,Inaba)or,Inaba)ctxAB,ctxAB,HgHgr r中等中等1001009090202

37、0Kaper et Kaper et al.(1984)al.(1984)CVCVD1D10202O395(ClaO395(Classical ssical Ogawa)Ogawa)ctxA,ctxA,胸腺嘧胸腺嘧啶营养啶营养缺陷型缺陷型无无4040N.DN.Df fN.DN.DLevine et Levine et al(1988b)al(1988b)CVCVD1D10505O395(ClaO395(Classical ssical Ogawa)Ogawa)ctxA, ctxA, hlyAhlyA中等中等100100N.DN.DN.DN.DLevine et Levine et al(198

38、8b)al(1988b)CVD10CVD103-HgR 3-HgR 569B(Ca569B(Cassical,ssical,Inaba)Inaba) ctxA ctxA hlyA:mer hlyA:mer 无无 28 28 100(Class100(Classical)63(Eical)63(EI Tor)I Tor) 2929（ClassicalClassical）83(EI Tox) 83(EI Tox) Levine Levine et al et al (1988a (1988a PERU-PERU-3 3 C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InaTor,Inaba)ba

39、) attRSI attRSI reca:htpreca:htpG-ctxB G-ctxB StrStrr r 轻轻微微 83 83 87 87 N.AN.Ae e Taylor Taylor er al er al (1994)(1994)PERU-PERU-14 14 C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InaTor,Inaba) ba) attRSIattRSIrecA:hrecA:htpG-ctxB tpG-ctxB StrStrr r, ,丝状，丝状，缺乏制动缺乏制动性性 无无 100 100 80 80 N.A N.A Taykor Taykor et al et al

40、 (1994) (1994) PERUPERU-15-15C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InTor,Inaba)aba)attRSIattRSIrecA:htpG-recA:htpG-ctxB StrctxB Strr r，无制，无制动性动性无无828260608080Kenner Kenner et et a(1995)a(1995)BENGBENGAL-AL-1515MO10(OMO10(O139)139)attRSIattRSIrecA:htpG-recA:htpG-ctxB StrctxB Strr r，无制，无制动性动性无无909083834242Coster Co

41、ster et al et al (1995)(1995)a a副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉挛，厌食，发热挛，厌食，发热b b服苗者粪便中排菌苗株的百分率服苗者粪便中排菌苗株的百分率c c用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率d d攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型霍乱弧菌的百分率霍乱弧菌的百分率e e未得到数据未得到数据f f未做未做 另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgAsIgA及血清及血清IgGIgG

42、反应，及黏膜免疫记忆反应，对反应，及黏膜免疫记忆反应，对CTCT及及CTBCTB的免疫佐剂活性进行了大量的免疫佐剂活性进行了大量的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认识。进展情况见表识。进展情况见表6-66-6。表表6-6 CT/CT-B6-6 CT/CT-B佐剂应用的抗原佐剂应用的抗原 抗原（佐剂）抗原（佐剂）途径途径参考文献参考文献蛋白质蛋白质 破伤风类毒素（破伤风类毒素（CTCT）p.op.o（Jackson et al,1993Jackson et al,1993） 链球菌链球菌M M蛋白（蛋白（

43、CT-BCT-B）i.mi.m（Bessen and Bessen and Tischetti,1988Tischetti,1988）链球菌链球菌 （CT-BCT-B） S.Mutans S.Mutans抗原抗原I/III/II（CT/CT-BCT/CT-B） p.op.o（Czerkinsky et Czerkinsky et al,1989;Wu and al,1989;Wu and Rusell,1993Rusell,1993）S.MutansS.Mutans蛋白质抗原（蛋白质抗原（CT-BCT-B） 流感病毒溶血素（流感病毒溶血素（CT/CT-BCT/CT-B）i.mi.m(Takah

44、ashi et al.,1990)(Takahashi et al.,1990)呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒FGFG糖蛋白（糖蛋白（CT/CT-CT/CT-B B） p.o,i.m p.o,i.m （Tomasi et al,1994Tomasi et al,1994） S.mutans Gtf.1 S.mutans Gtf.1：pho Apho A融合蛋白融合蛋白 i.mi.m（Walsh,1993Walsh,1993） 多糖多糖p.op.o(Tomasi et al,1994)(Tomasi et al,1994) 沙门氏菌多糖（沙门氏菌多糖（CT-BCT-B）p.op.o（Orr et

45、al.,1994Orr et al.,1994） P Paeruginosaaeruginosa多糖（多糖（CTCT）p.op.o（Abraham and Abraham and Pobinson,1991Pobinson,1991）病毒病毒 完整流感病毒（完整流感病毒（CTCT）p.op.o(Chen and Strober 1990)(Chen and Strober 1990) 仙台病毒（仙台病毒（CTCT）p.o,i.p.o,i.m m（Nedrud et al. 1987Nedrud et al. 1987） Neasles Neasles病毒（病毒（CT-BCT-B）i.ni.n(

46、Muller et al,1995)(Muller et al,1995) 呼吸道合胞病毒（呼吸道合胞病毒（RSVRSV）i.ni.n(Reuman et al, 1991)(Reuman et al, 1991)细菌细菌/ /原生动物原生动物 幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（CTCT）p.op.o(Czinn and Nedrud,1991)(Czinn and Nedrud,1991)弓形体（弓形体（CTCT） p.o p.o （Bourguin et al.,1991Bourguin et al.,1991） 阿米巴原虫多肽阿米巴原虫多肽-CT-B-CT-B融合蛋白融合蛋白 p.o p.o (Z

47、hang et al,1995b) (Zhang et al,1995b) 二、痢疾菌苗（二、痢疾菌苗（Dysentery vaccine）痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率始终居始终居2424种法定传染病的前二位。种法定传染病的前二位。主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆噬泡膜进入胞浆. .临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合症。重，甚至引起神经症状和血尿综合症。痢

48、疾菌共有痢疾菌共有4 4群群：A A志贺氏痢疾菌（志贺氏痢疾菌（Shigella Shigella dysenteriaedysenteriae），），B B福氏痢疾菌（福氏痢疾菌（S.flexneriS.flexneri），C C鲍氏痢疾菌（鲍氏痢疾菌（S.bordiiS.bordii）和）和D D宋内氏痢疾菌宋内氏痢疾菌（S.sonneiS.sonnei）。）。按其菌膜表面按其菌膜表面LPS-OLPS-O抗原分为抗原分为4444个血清型。个血清型。目前已知至少目前已知至少2727个基因和个基因和1515个蛋白与痢疾菌个蛋白与痢疾菌入侵宿主细胞相关，它们作为入侵宿主细胞相关，它们作为IIII

49、II型分泌系统的型分泌系统的调节子与效应子，以接触依赖方式被分泌进入调节子与效应子，以接触依赖方式被分泌进入宿主细胞。宿主细胞。1.1.死菌苗（死菌苗（Dead bacteria vaccine）五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，但没有保护效果；但没有保护效果；用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明LPS-OLPS-O多糖是保多糖是保

50、护性抗原；护性抗原；Robbins(1992)Robbins(1992)将痢疾菌将痢疾菌LPSLPS与不同蛋白载体（与不同蛋白载体（TTTT，DTDT）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。宋内氏宋内氏LPS-O-LPS-O-蛋白（蛋白（TTTT，DTDT）有保护作用，）有保护作用，RobbinsRobbins（19961996）将多糖）将多糖- -蛋白结合苗用于越南士兵，报告宋氏蛋白结合苗用于越南士兵，报告宋氏多糖多糖- -蛋白结合苗保护效果达蛋白结合苗保护效果

51、达70%70%。 2.2.活菌苗活菌苗（Living bacteria vaccine）采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。MeitertMeitert等（等（19841984）在胆盐平皿连续传代）在胆盐平皿连续传代3232次获得次获得S.f2aS.f2a减毒株减毒株IstratiT32IstratiT32；8080年代初中国近一万人现场观察，证实年代初中国近一万人现场观察，证实T32T32菌苗安菌苗安全，有保护活性，效果与免疫次数和剂量有关。全，有保护活性，效果与免疫次数和剂量有关。 p8080年代中国国内以年代中国国内以T32T32为受体

52、株开始致力于构为受体株开始致力于构建双价痢疾菌苗株的研究。建双价痢疾菌苗株的研究。n牟兆钦等，牟兆钦等，19891989年将一编码宋内氏菌年将一编码宋内氏菌LPS-OLPS-O抗抗原的大质粒转移至原的大质粒转移至T32T32菌中获得福氏菌中获得福氏2a2a宋内氏双宋内氏双价痢疾菌苗株价痢疾菌苗株FS-18FS-18，FSM2117FSM2117；宋树珍等构建；宋树珍等构建了了FSFS痢疾双价菌苗株，其中痢疾双价菌苗株，其中FSM2117FSM2117识别福氏识别福氏2a2a和识别宋内氏痢疾苗和识别宋内氏痢疾苗LPS-OLPS-O抗原；抗原；n林纪胜林纪胜(1999)(1999)构建了构建了S.

53、flexenri 2aS.flexenri 2a和和S.dysenteria IS.dysenteria I双价痢疾菌株，有双价免疫原双价痢疾菌株，有双价免疫原性，现性，现FSM2117FSM2117与与FSFS两株痢疾双价菌苗均已获国两株痢疾双价菌苗均已获国家新生物制品证书和试生产文号。家新生物制品证书和试生产文号。 p9090年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主要针对痢疾菌毒力相关基因的插入失活或缺失的方要针对痢疾菌毒力相关基因的插入失活或缺失的方法，构建减毒突变株，目的是保存其入侵能力，限法，构建减毒突变株，目的是保存其入侵能力，限制其无限繁殖

54、能力。对其免疫原性和保护效果进行制其无限繁殖能力。对其免疫原性和保护效果进行了大量实验室研究。了大量实验室研究。n国外工作主要集中在福氏国外工作主要集中在福氏2a2a，福氏，福氏5 5型或型或Y Y型。构型。构建出福氏建出福氏2a-2a-宋内氏双价侵袭的菌苗株，目的是降低宋内氏双价侵袭的菌苗株，目的是降低目前非侵袭双价苗的免疫剂量，提高免疫原性。目前非侵袭双价苗的免疫剂量，提高免疫原性。 p 痢疾杆菌痢疾杆菌IIIIII型分泌系统将不同侵袭蛋白分泌和导型分泌系统将不同侵袭蛋白分泌和导入宿主细胞的调节分子与效应分子的鉴定，可能会入宿主细胞的调节分子与效应分子的鉴定，可能会找到构建痢疾基因工程菌苗

55、新的靶分子和靶基因。找到构建痢疾基因工程菌苗新的靶分子和靶基因。 苗株苗株 亲株亲株 表型表化表型表化（genegene） 安全性安全性 保护性保护性 Ic Ica a播散播散 ICICa a 生长生长 其它其它 g gp pc c m md d h he e gpgpm mh hEC104 EC104 E.coliE.coliS.flexneri2aS.flexneri2a (kcpA) (kcpA) (iuc(iucA) A) + +- - - -EcSF2aEcSF2a-1 -1 E.coli E.coliS.flexneri2aS.flexneri2a (kcpA)(kcpA)(iuc

56、(iucA)A)- - -SC560 SC560 S.flexneri5S.flexneri5( (icsA) icsA) + +_ _+ +SC445 SC445 S.flexneri5S.flexneri5( (ics:Tics:TnphoA) nphoA) ( (envZ,envZ,ompR) ompR) + + +- -SC5700 SC5700 S.flexneri5S.flexneri5( (ics:Tics:TnphoA)nphoA)(iuc:T(iuc:Tn10) n10) + + +Vc77 Vc77 E.coli E.coliS.flexneri2aS.flexneri2a

57、 (pur) (pur) (R(Rif)if) + +- -Vc3359 Vc3359 S.sonnei S.sonnei (pur)(pur)(R(Rif)if)+ +- -TSF-21 TSF-21 S.flexneriYS.flexneriY (thyA) (thyA) (T(Ts) s) +2+210109 9cfucfu + +表表6-7 6-7 入侵性痢疾基因工程菌苗候选株研制情况入侵性痢疾基因工程菌苗候选株研制情况苗株苗株 亲株亲株 表型表化（表型表化（genegene） 安全性安全性 保护性保护性 Ic Ica a播散播散 ICICa a 生长生长 其其它它 gpgpc c m

58、 md d h he e gpgpm mh hSFL124 SFL124 S.flexneriY S.flexneriY( (aroD) aroD) + +SFL107SFL1070 0 S.flexneri2aS.flexneri2a( (aroD)aroD)2 210108 8cfu cfu - -EcSf2aEcSf2a-2 -2 E.coliE.coliS.flexnerS.flexneri2ai2a (kcpA)(kcpA)( (aroD)aroD)2 210109 9cfu cfu + +CVD120CVD1203 3 S.flexneri2aS.flexneri2a( (virG

59、) virG) ( (aroA) aroA) + + +FS5416FS5416b b S.sonnei S.sonnei S.flexneri2aS.flexneri2a( (aroD)aroD)+ + +FS5402FS5402b bS.sonnei S.sonnei S.flexneri2aS.flexneri2a( (aroD)aroD)+ + +FS5411FS5411b bS.sonnei S.sonnei S.flexneri2aS.flexneri2a( (aroD)aroD)+ + +FS5414FS5414b b( (aroD)aroD)+ + +注：注：a胞内扩散；胞内扩

60、散；b国内研制；国内研制；c,gp豚鼠；豚鼠；d,m猴；猴；e,h人人三、产毒性大肠杆菌苗三、产毒性大肠杆菌苗（ETEC vaccine） ETECETEC是婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。是婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。全球年病例为全球年病例为2.12.1亿次，死亡病例达亿次，死亡病例达3838万，多为万，多为5 5岁以岁以下的儿童。下的儿童。其致病特征是分泌其致病特征是分泌STST和和LTLT毒素及菌膜表面存在致病相毒素及菌膜表面存在致病相关的菌毛抗原关的菌毛抗原CFAsCFAs。正在采用减毒痢疾菌为载体进行。正在采用减毒痢疾菌为载体进行LTLT或菌毛抗原的表达，进行多价菌苗研制的前期工