层析介质的品质评价

1、层析介质的品质评价1. 耐压 & 流速1.1 介质的耐压介质耐压是介质性能的一个方面，耐压由介质的材质，交联方式决定，与使用过程没 有关系。某一个特定的介质其耐压是固定的。最大耐压是介质的外观形态、内部孔径 结构不得改变的临界点。耐反压是描述介质在一定条件下使用过程中的一个状态，不仅与介质的耐压有关，与使用时的流速，柱床高度，缓冲液成分都有一定的关系。介质的流速是根据介质使用 过程中反压的变化测定的，当反压等于介质的耐压时此时这种特定条件测定的流速即 为介质的最大流速。我们在使用的过程监测的都是介质的耐反压，耐反应与多方面因素有关，通常柱床高 度越高反压越大，介质的粒径越小装填后反压越

2、大，层析缓冲液的粘度越大反压越大， 所以我们在使用过程中检测反压通常不得超过介质耐压的三分之一。1.2 常用介质的耐压a. 硅胶材质的介质耐压大于10MPa，属于高压介质。b.聚苯乙烯材质的介质耐压在0.5MPa，属中压介质。c.琼脂糖材质的介质，如GE公司的 Sepharose 4FF和 6FF 系列和 Sepharose XL 系列，及汇研生物Focurose 4FF 和 6FF 系列及 Focurose XL 系列介质的耐压小于0.3MPa.d.高刚性琼脂糖介质，如GE公司的 Capto 及汇研生物的Focurose HF/HPR 系列的层析介质的耐压在0.5MPa，此类介质是生物大分子

3、纯化介质发展的趋势，其多糖材质使其具有良好的亲水性及生物相容性，两种多糖的交联互补也是其具有较大的刚性，在传 质速率，流速方面优势明显。1.3 介质的流速介质的流速指在给定的条件下，如给定压力，给定柱床高度，给定缓冲液类型测的数 值，不同方法测定的流速不一样。a. 同一材质的介质，粒径越小流速越小。b. 同一材质的介质，装填高度越高流速越小。2. 选择性 & 分辨率2.1 介质的选择性了解介质的选择性先从介质的结构开始，除凝胶过滤介质是要靠填料的孔和微球之间的间隙去分配不同物质的，离子，亲和，疏水三种吸附层析介质都有一定的选择性， 其选择性是由介质结构中的配基决定的。一个介质的配基确定

4、后，其可识别的分子或基团就确定了，介质的选择性顾名思义也就是其识别能力。介质的选择性是介质的一个特征，选择性由其配基决定，亲和的选择性最高，大多亲和介质都趋于一对一的精准识别，疏水介质的分辨率也很高，离子交换介质识别带一类电荷的物质，相比亲和选择性就要差一些。不同类型的介质选择性和适用性有差异，选择性通常是和适用性融合起来的，一种介质能识别某种物质，那么这个物质就适用此介质来纯化。2.2 介质的分辨率介质的分辨率是介质分离物质的能力描述，这与多方面因素有关。a. 介质的粒径越小，装柱后理论塔板数越高，分辨率也越高。如GE 公司的 SepharoseFF系列介质及汇研生物FocurFF 系列介质

5、的分辨率就要比GE公司的 Sepharose HP 系列，及汇研生物Focurose HP 系列介质的分辨率小，也因此HP 系列的介质称为高分辨率介质。b. 在一定范围内，介质的结合载量的提高会导致其分辨率下降。c. 介质装填时，随装填高度的增加分辨率也增加，但是反压也增大。d. 层析缓冲液也会影响介质的分辨率，比如离子交换介质使用时，用2M NaCl 直接洗脱，此时就失去了分辨带不同电荷物质的能力。e. 层析过程的控制也会影响介质的分辨率，比如流速，通常流速增大分辨率降低。CIP,避免沉积f. 介质的保养及清洗也会影响介质的分辨率，使用后要及时对介质进行在介质中的杂质影响分离过程，导致介质的

6、分辨率下降。3. 粒径分布3.1 粒径对介质品质的影响：a. 同一材质的介质，粒径越小装柱后有更高的理论塔板数，所以粒径越小分辨率越高。b. 同一材质的介质，粒径越小同样体积的介质比表面积越大，所以载量越高。c. 同一材质的介质，粒径越小装柱后反压越大，流速越小。d. 同一材质的介质，粒径越小理论塔板数越高，其回收率也随粒径的变小而增大。这可能与分辨率越高，在收集时开始收集状态更好把控有关。e. 同一材质的介质，粒径分布的越均一或分布区间越小, 装填后理论塔板数就越高，分辨率就越高。粒径一致的介质称为单分散介质，其分辨率最高，当然粒径分布对填料的影响同时遵循粒径大小对介质性能的影响，如单分散为

7、60um 的介质比单分散粒径为 25um 的介质的分辨率要低。f. 同一粒径分布范围的介质，分布区间的正太分布区间越小，越集中，其分辨率越高。如下图汇研生物的填料粒径分布就相当均一。g. 同一粒径分布范围介质，平均粒径也会影响其品质和性能，平均粒径偏小分辨率高，但是流速小，偏大流速大，但是分辨率低。如都是45-165um 范围的介质，平均粒径为 75um 的就比平均粒径为100um 的装填后反压要大，分辨率要高。h. 同一材质，同一粒径分布范围的填料（如琼脂糖FF 系列介质），不同厂家在粒径的均一性上相差较大，最终也会导致在载量，流速，分辨率等方面差异较大。同一材质的介质，粒径越小往往价格越高

8、。3.2 粒径分布的特征粒径分布包括两个方面平均粒径和粒径范围。10um-100uma. 硅胶系列介质的粒径，目前市场上有单分散微球（粒径均一的，从的都有），也有不定型的（介质颗粒是不规则的形状的，粒径分布宽泛），单分散的比不定型的品质要好很多，当然价格也贵很多。b. 聚合物系列介质的粒径，目前市场上单分散微球居多，粒径从10um 到 200um 的都有。4. 孔径分布4.1 导论我们在纯化生物大分子的时候，层析技术是最普遍和通用的纯化方法之一，层析介质 又是层析技术的核心，那么层析介质的哪些因素会影响其品质了，最终会影响我们纯 化工艺过程及纯化结果呢？今天介绍层析介质的孔径分布对介质分离过程

9、的影响。层析介质孔径分布，不同的测定方法测定出来差异较大。不同物质分离纯化在孔径选择上略有差异。不同孔径分布的纯化介质吸附解吸附的热动力学过程有差异。不同孔径分布的纯化介质耐压性，载量，结合结合强度方面有差异。汇研生物开发的超大孔琼脂糖基质系列介质孔径大于100nm ，测定方法是逆向体积排阻层析法。如汇研生物的PS Focurose HPL 在纯化带囊膜的病毒颗粒方面表现出优秀的性能。生物大分子纯化层析介质，以多糖基质的居多，交联琼脂糖制备而成的介质应用最为广泛，如GE 公司的 Sepharose 4FF 和 6FF 系列，及汇研生物Focurose 4FF 和 6FF 系列介质，在离子交换介

10、质，亲和介质，疏水介质制备上应用最为广泛。其中4FF 的平均孔径是40nm ，而 6FF的平均孔径是27nm 。 100KD 以内的物质优选6FF 基质的介质，100KD 到 1000KD 的物质优选4FF 基质的介质。葡聚糖交联琼脂糖微球介质，如GE 公司的Sepharose XL 及汇研生物的Focurose XL系列介质，其即可避免介质和蛋白结合的空间位阻，又提高了可利用配基的密度，从而大幅度提高了介质的载量，比FF 基质的填料有明显的载量优势，也广泛用于生物大分子的分离纯化。如DEAE Focurose 6XL 在肝素钠及胰蛋白酶的分离纯化中表现出良好的品质，广泛用于天然蛋白的分离纯化。XL 系列的填料孔径平均在36nm 左右。纯化小于 100KD 的物质优选。琼脂糖交联纤维微球介质，如GE 公司的 Capto 及汇研生物的Focurose HF/HPR 系列的层析介质，此类介质比琼