DNA重组及重组DNA技术解读

1、第二十一章第二十一章 DNA 重组和重组重组和重组DNA 技术技术 DNA Recombination and Recombinant DNA technology 77 1 目录目录 广义上， 任何造成基因型变化的基因交流过程 ?DNA重组重组（DNA recombination）是指不）是指不同同DNA分子断裂和连接而产生分子断裂和连接而产生 DNA片段片段的交换并重新组合形成新的交换并重新组合形成新DNA 分子的过程。分子的过程。 ?重重 组组 DNA 技技 术术 （ recombinant DNA technology ）是指在体外将两个或两个以）是指在体外将两个或两个以上上DNA 分

2、子重新组合并在适当细胞中增殖分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新形成新DNA 分子的过程。分子的过程。 77 目录目录 2 DNA重组的意义 ?发生在生物体内基因的交换或重新组合是生物遗传变异遗传变异的一种机制。 ?在进化、繁殖、病毒感染、基因表达以及致癌基因激活等过程中，基因重组都起重要作用。 ?基因重组也归类为自然突变自然突变现象。 77 目录目录3 第一节第一节 自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature 77 4 目录目录 DNA重组

3、重组 同源重组同源重组 (homologous recombination) 接合作用接合作用 (conjugation) 转化作用转化作用 (transformation) 转导作用转导作用 (transduction) 位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination) 转转 座座 (transposition) 异常重组异常重组 77 目录目录5 一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式 ? 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination) ，又称又称基本

4、重基本重组（组（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。链片段的交换。 ? 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机的同源重组为例，了解同源重组机制的制的Holliday 模型。模型。 77 目录目录6 Holliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤： ? 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐； ? 一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个 DNA对应的链连接，形

5、成对应的链连接，形成 Holliday 中间体；中间体； ? 通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链 DNA； ?Holliday 中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为： 片段重组体片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 77 目录目录7 ? 片段重组体片段重组体 （见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同

6、一亲本本DNA。 ? 拼接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本 DNA。 77 目录目录8 5 3 3 3 5 内切酶内切酶 5 3 5 3 3 (recBCD) 5 3 5 5 3 5 3 5 5 3 3 5 3 5 5 内切酶内切酶 3 (recBCD) 5 3 3 5 3 5 3 3 DNA 连接酶连接酶 77 DNA 侵扰侵扰 (recA) 5 3 3 5 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 5 3 Holiday 中间体中间体 9 分支

7、迁移分支迁移 (recA) 53 35 35 53 Holiday 中间体中间体 35 内切酶内切酶 (ruvC) 5 3 3 5 35 353 DNA 5 连接酶连接酶 3 5 3 5 片片段段重重5 53 组组体体3 3 5 3 内切酶内切酶 5 (ruvC) 3 5 3 5 55 3 3 DNA 拼拼连接酶连接酶 3 5 接接5 重重3 组组35 77 体体5 3 10 DNA重组重组 同源重组同源重组 (homologous recombination) 接合作用接合作用 (conjugation) 转化作用转化作用 (transformation) 转导作用转导作用 (transdu

8、ction) 位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination) 转转 座座 (transposition) 77 目录目录11 第二节第二节 重组重组DNA技术技术 又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 77 12 目录目录 重组重组DNA 技术的发展史技术的发展史 1865年年 G.J.Mendel 的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验

9、。 1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组第一个重组DNA 分子分子。 1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA 技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物药物。 1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA 技术生产技术生产胰岛素胰岛素的工厂。的工厂。 1997年年 英国罗林研究所成功的英国罗林研究所成功的克隆了多莉克隆了多莉。 77 13 目录目录 77 目录目录14 本节主要内容：本节主要内容： ?相关概念相关概念

10、 ? DNA 克隆克隆 ? 工具酶工具酶 ? 目的基因目的基因 ? 基因载体基因载体 ?基本原理基本原理 ?重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系 77 目录目录15 ?一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆 (clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷 (cloning) ， 77 目录目录16 （一）（一） DNA克隆克隆贝的集合。贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化即无性繁殖。即无性繁殖。技术水平：技术水平： (molecular clone) DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个

11、体克隆（动物或植物） 77 目录目录17 ?分子克隆分子克隆（即（即 ?DNA克隆克隆 应用酶学的方法，在应用酶学的方法，在 体外体外将各种来源的遗将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的 DNA）与载体）与载体DNA接合成一接合成一具具有有 自自 我我 复复 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 复复 制制 子子(replicon) ，继而通过，继而通过 转化或转染转化或转染 宿主细胞，宿主细胞， 筛筛选选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取提取获得大量同一获得大

12、量同一 DNA分子，也称分子，也称 基因克隆或基因克隆或重组重组DNA (recombinant DNA) 。 77 目录目录18 ? 生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 ? 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。 ? 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或 DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 77 目

13、录目录19 （二）工具酶（二）工具酶 ? 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶? DNA 聚合酶聚合酶 ? 逆转录酶逆转录酶 ? T4DNA连接酶连接酶 ? 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ? 末端转移酶末端转移酶 ? Taq DNA 聚合酶聚合酶 77 目录目录20 重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶 工工 具具 酶酶 功功 能能 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA DNA连接酶连接酶 催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段

14、连接分子或片段连接 DNA聚合酶聚合酶 合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析序列分析 填补填补3末端末端 Klenow片段片段 又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的5?3? ?聚合、聚合、3?5? ?外切活性，而无外切活性，而无5?3? ?外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3? ?末端标记等末端标记等 反转录酶反转录酶 合成合成cDNA 替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析 多聚

15、核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶末端转移酶 在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 77 21 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ? 定义：定义： 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。 Bam H

16、GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G 77 目录目录 22 ? 分类：酶的组成、所需因子及裂解分类：酶的组成、所需因子及裂解 DNA的方的方式式 、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用 型）型） ? 作用：作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。 77 目录目录23 ? 命名：命名： Hin d Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶 属属 系系 株株 序序 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个

17、字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株；第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 77 目录目录24 回文结构回文结构(palindrome) GGCCTAATGG CC 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口 77 目录目录25 类酶识别序列特点类酶识别序列特点Hind GTCGAC CAGCTG GTC CAG + GAC CTG 平端切口平端切口 Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG + GATCC G 粘端切口粘端切口 77

18、 目录目录26 （三）目的基因（三）目的基因(target gene) ?cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与 RNA ( 通常指通常指mRNA 或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。以。以单链单链cDNA 为模板、经聚合反应可合成双为模板、经聚合反应可合成双链链cDNA 。 ? 基因组基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 77 目录目录27 （四）基因载体（四）基因载体 ? 定义定义 为携带目的

19、基因，实现其无性繁为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些一些DNA分子。分子。 ? 常用载体常用载体 质粒质粒DNA 噬菌体噬菌体DNA 病毒病毒DNA 77 目录目录28 ?克隆载体克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。 ?表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为 表达载体表达载体。 77

20、 目录目录29 1.1.质粒质粒 (plasmid) 特点特点: : 能在宿主细胞内能在宿主细胞内独立自主复制独立自主复制；带有某些遗；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 77 目录目录 30 77 31 2.2.噬菌体噬菌体(phage) ? 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用 cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆） ? M13 噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ 基因）基因） M13mp 系列系列 pUC 系列系列 77 目录目录

21、 32 4.其他其他 ? 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) ? 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) ? 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 杆状病毒）杆状病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒，（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒， 77 目录目录33 二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理 ? 基本原理基本原理 目的基因的获取目的基因的获取 克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞导入受体细胞 外源基因与载体的连

22、接外源基因与载体的连接 重组体的筛选重组体的筛选 克隆基因的表达克隆基因的表达 77 目录目录 34 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 分分 切切 接接 转转 筛筛 分离目的基因分离目的基因 限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体 拼接重组体拼接重组体 转入受体细胞转入受体细胞 筛选重组体筛选重组体 77 目录目录35 （一）目的基因的获取（一）目的基因的获取 1.化学合成法化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。 2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA l

23、ibrary) 3. cDNA文库文库(cDNA library) 4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) ( 见第见第22 章章) 77 目录目录36 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的 DNA序列。序列。 77 目录目录37 ?从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因 基因组基因组DNA文库文库 存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合 组织或细胞染色体组织或细胞染色体 DNA 限制性内切酶限制

24、性内切酶 基因片断基因片断 克隆载体克隆载体 重组重组DNA分子分子 受体菌受体菌 含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌 77 38 限制酶切位点限制酶切位点 cos L R cos 真核生物染真核生物染 色体色体DNA 限制酶消化限制酶消化 cos L 左臂左臂 限制酶部分消化限制酶部分消化 除去中间片段除去中间片段 R cos 右臂右臂 20 Kb DNA 片段片段 外源外源DNA 与载体与载体DNA混合混合 cos L 20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 R cos 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体 感染大肠杆菌感染大肠杆菌 基因文库基因文库 用随机切割的

25、真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体77 DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 39 ? 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 mRNA 反转录酶反转录酶 cDNA 复制复制 双链双链cDNA 载体载体 重组重组DNA分子分子 受体菌受体菌 cDNA文库文库 AAAA 逆转录酶逆转录酶 A A A A T T T T 碱水解碱水解 T T T T DNA聚合酶聚合酶 SISI核酸酶核酸酶 77 40 （二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建 目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。 77 目录

26、目录41 （三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接 1.粘性末端连接粘性末端连接 77 目录目录42 同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接 GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用目的基因用 Bam H切割切割 GCCTAGGCCTAGBam H切割反应切割反应 GATCC G 载体载体DNA 用用Bam H切割切割 + GATCCGGATCCGGGATCCCCTAG GGGATCCCCTAG GGGATCCCCTAG GGGATCCCCTAG GT4 DNA 连接酶连接酶 15o C 载体自连载体自连 重组体重组体 77 目的基因自连目的基因自连 43 GGAT

27、CCCCTAG GGGATCCCCTAG G不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco R切割位点切割位点 Bg l切割位点切割位点 GCTTAAAATTCGCTTAAGGAATTCAGATCTTCTAGAATCTAGGATCTAEcoR双酶切双酶切+ Bg l Eco R双酶切双酶切+ Bg l AATTCAATTCGATCTAGGGATCT+ AATTCGATCTAGAT4 DNA 连接酶连接酶 15o C 配伍末端的配伍末端的GCTTAAAATTCG连接情况和同一连接情况和同一ATCTAGGATCTA限制酶切位点连限制酶切位点连重组体重组体 接相似。

28、接相似。 77 44 2.平端连接平端连接 77 目录目录45 目的基因目的基因 载体载体 限制性内切酶限制性内切酶 限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNA 连接酶连接酶 15o C 重组体重组体 目的基因目的基因 自连自连 46 载体自连载体自连 77 3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接 77 目录目录47 目的基因目的基因 5 3 5 3 限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶 5 3 载体载体DNA 限制酶限制酶 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶 3 5 末端转移酶末端转移酶 + dTTP T(T)nT 3 5 5 3 A(A)nA 3 5 5 3 末端转移酶末端转

29、移酶 + dATP A(A)nA 3 5 3 T(T)nT 5 T4 DNA 连接酶连接酶 15o C 重组体重组体 77 48 4.人工接头人工接头(linker)连接连接 77 目录目录49 人人工工接接头头及及其其应应用用 Eco R 5 - CCGAATTCG 3- GGCTTAAGC Eco R Eco R Eco R 77 50 （四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌 ?受体菌条件：受体菌条件： 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态(competent)?导入方式：导入方式： 转化转化 (transformation) 转染转染

30、(transfection) 感染感染 (infection) 77 目录目录51 77 目录目录52 （五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 抗抗 ( (药药插插性性入入标标失失记记活活选选法法择择) ) 77 53 互互补补 利用利用77 互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 54 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤 载体载体 质粒质粒 噬菌体噬菌体 病毒病毒 目的基因（外源基因）目的基因（外源基因） 基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成 PCR产物产物 开环载体开环载体DNA 限制酶消化限制酶消化 目的基因目的基因 转化转化 体外包装，转染体外包装，转染

31、 重组体重组体 连接酶连接酶 带重组体的宿主带重组体的宿主 筛选筛选 表型筛选表型筛选 酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定 77 菌落原位杂交菌落原位杂交 55 目录目录 （六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达 77 目录目录56 1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用) ? 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列 多接头克隆位点多接头克隆位点 ? E.coli 表达体系的不足表达体系的不足： 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组 DNA； 不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达

32、的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。 77 目录目录57 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞） ? 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA 及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 ? 缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济 ? 转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程 方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE 葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 77 目录目录 58 第三节第三节 重组重组DNA技术与医学技术与医学 的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大 DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 77 59 目录目录 一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，根据基因定位克隆之并研究其性质， ? 疾病