具有潜在抑制肠道致病菌能力的乳酸菌的筛选

1、具有潜在抑制肠道致病菌能力的乳酸菌的筛选Abstract Objective Lactic acid bacteria( LAB) with strongresistance of acid and bile salt were screened from laboratory , and their adhesion ability of intestinal epithelial cells and inhibition ability to intestinal pathogens were studied.MethodThe resistance of acid and bile sa

2、lt and the adhesion ability of IEC6 cells were studied by artificial gastrointestinal fluid and cocultured with IEC6 cells , respectively , and the bacteriostatic effect was deter mined by single agar plate diffusion method.ResultThe survival rate of 10 strains were cultured 3 h in pH 3.0 artificial

3、 gastric juice was greater than 44.00% and cultured 4h in pH 8.0 artificial intestinal juice was greater than 51.56%, and cultured 24 h in medium containing 0.30% bile salts was greater than 20.00%； the adhesion number of C13 , A03, A17 and A90 on IEC6 cells was greater than 8 cells ; the inhibiting

4、 capacity of C13 ,A03 on Clostridium difficile , Salmonella and Escherichia coli was stronger than others the antibacterial circle diameter was greater than 22 mm.C13 and A03 were identified as Lactobacillus rhamnosu and Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequencing , respectively.ConclusionL.rhamn

5、osu C13, L.plantarum A03 with the strong ability of acid and bile salt resistance and adhesion to epithelial cells ， which have good inhibitory effect on pathogenic bacteria ， and can be used as a fit probiotic candidate strain.Key words Lactic acid bacteria ； Resistance of acid and bile salt; Adhes

6、ion ； Inhibition of pathogenic bacteria踢道菌群在维持机体的健康过程中发挥着重要的作用，与人体的消化营养、免疫代谢、生物拮抗等密切相关。抗生素由于见 效快、针对性强等特点被大量用于疾病的治疗，而其过度使用导致了肠道菌群的紊乱，引起了艰难梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌等 肠道致病菌的繁殖，进而引发机体腹泻、呕吐、酸中毒等症状， 同时也会导致机体易感染情况增加，引起二重感染，降低其免疫功能，对机体的健康产生了严重的影响2-3 o乳酸菌作为人体肠道中的重要有益微生物，可以通过产生短链脂肪酸、乳酸、甲酸、细菌素、过氧化氢及小分子肽类等一系 列代谢产物来拮抗肠道致病菌；同

7、时乳酸菌通过其表面的黏附素 与肠黏膜细胞紧密结合，形成生理屏障，并通过与致病菌竞争肠 道上皮细胞的黏附位点、生存空间及营养物质来抑制肠道病原菌的生长，改善肠道菌群紊乱的状况，达到改善肠道微环境的效果。 乳酸菌作为益生菌必须对肠道的酸和胆盐等不良环境有一定的 耐受性，同时能够黏附在肠上皮细胞上才能发挥其益生功能。笔者从实验室保藏的乳酸菌中筛选出耐酸耐胆盐能力及黏附能力 较强的乳酸菌，研究其对肠道病原菌的抑制能力，为其进一步应用提供理论依据。1材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与主要试剂。试验菌株，江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室提供。 胆盐，美国Difco公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海

8、生工生物工 程公司；DNA提取试剂盒，上海生工生物工程公司； 艰难梭菌、 大肠杆菌、沙门氏菌，中国微生物菌株保藏中心；IEC-6细胞，上海麦莎生物科技有限公司；DMEM培养基，美国Invitrogen公 司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；强化梭菌培 养基，青岛海博生物技术有限公司；抗生素药敏试纸，杭州天和 微生物试剂有限公司。1.1.2 主要仪器设备。JF-SX-500全自动灭菌锅，日本TOMY 公司；Thermo Scientific 1300 生物安全柜、Legendmach1.6R 高 速冷冻离心机，美国塞默飞世尔科技有限公司； OlympusCX41生 物显微镜，日本 Ol

9、ympus公司；UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司；PCR扩增仪，美国ABI公司；In万nity3026凝胶成像 系统，法国 Vilber Lourmat公司。1.1.3 主要试剂的配制。模拟胃液：0.3%勺胃蛋白酶溶于 PBS溶液，1 mol/L HCl调 pH至3.0,经0.22以屣膜过滤除菌，现配现用。模拟肠液：0.1%勺胰蛋白酶溶于PBS溶液，0.4% NaOH溶液 调pH至8.0,经0.22以m滤膜过滤除菌，现配现用。1.2 方法1.2.1 乳酸菌的培养处理。将活化后的乳酸菌按3%勺接种量接种到MRS液体培养基中，37 C培养24 h后，10 500 r/min离心10 mi

10、n收集菌体，用灭菌 的PBS溶液将菌体洗涤后悬浮，并调整其OD560nm为1.0, 4 C 冰箱冷藏备用。1.2.2 IEC-6细胞的培养。将IEC-6细胞置于 DMEM培养液中，于37 、5%CO2的培 养箱中进行培养，隔天更换1次培养液，当细胞增殖融合率达80% 时，用0.25%勺胰酶（0.02%EDTA消化细胞，传代5次后进行下1.2.3 致病菌的培养与处理。将沙门氏菌、大肠杆菌以3%勺接种量接种到LB液体培养基 中，艰难梭菌以3%勺接种量接种到 RCM培养基中，活化3代, 37 C培养24 h,利用平板计数法测定其活菌数，用灭菌的培养 基调整其活菌数为107 CFU/mL, 4 C冷藏

11、备用。1.2.4 乳酸菌的耐酸耐胆盐能力。分别取 1.0 mL的乳酸菌菌 悬液于9.0 mL的模拟胃液和9.0 mL的模拟肠液中，于37 c分 别培养3 h和4 h后测定其活菌数，按公式(1)、(2)计算其存 活率。将乳酸菌菌悬液按3%勺接种量接种于含0.30%且盐及不含 胆盐的MRS液体培养基中，37 C培养24 h测定其OD600nm 值，按公式(3)计算其存活率。存活率=3 h的活菌数/0 h的活菌数X 100% (1)存活率二4 h的活菌数/0 h的活菌数X 100% (2)存活率=含胆盐培养基的OD值/不含胆盐培养基的 OD值 X 100% (3)1.2.5 乳酸菌的黏附能力。调整I

12、EC-6细胞的浓度为2X 104 cells/mL,接种于培养板中， 预先置入22 mmx 22 mm无菌盖玻片，使细胞贴附盖玻片生长， 37 C、5%CO2培养箱中培养。用PBS冲洗并调整培养后的乳酸 菌，使其菌体浓度为 1X108 CFU/mLo待细胞长成致密单层后， 用PBS缓冲液漂洗细胞2次，然后每孔加入不含抗生素的1 mLDMEM培养液和1 mL上述制备好的乳酸菌菌悬液，轻轻摇晃混匀，置于CO2培养箱继续孵育，每株菌重复 3孔。培养60 min后，用PBS缓冲液洗涤细胞5次，除去未黏附 的乳酸菌，然后加入无水甲醇固定 20 min ,对细胞进行革兰氏染 色，显微镜下随机选取 20个视野，计算100个细胞上黏附的乳 酸菌个数，以平均每个细胞所黏附的乳酸菌个数表示黏附能力。1.2.6 乳酸菌的抑菌能力。采用单层琼脂平板扩散法，将固体 LB培养基溶化后倒入平 板中，待冷凝后，取菌液浓度为 108 CFU/mL的0.20 mL致病菌 菌液加入培养基平板上，用无菌