DNA提取中各种试验试剂作用原理

1、DNAI取中各种实验试剂作用原理 1、 STE是 Tris-Hcl 、EDTA Nacl 的混合液。其总体作用是为 DN 破供保护环境，在此环 境下 DNA 可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。 Tris.HCl 提供缓冲体系，DNAS这一体系中呈稳定态。 EDTA 是 DNAB的抑制剂，可以防止细胞破碎后 DNAB降解 DNA NaCl,有利于 DNA 的溶解。 2、 SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS(十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate ) 使 DNA 与蛋白质分离，在高温(55 65C)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸，然后采用提高

2、盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，离心后除 去沉淀， 3、 苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由 于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子 溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。 缺点：1.能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly (A) RNA 2.不能完全抑制 RNase的 活性。 Tris 酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。 4、 氯仿的作用 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用

3、氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 (酚易溶于氯仿中) 5、 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少 气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及 下层有机溶剂相维持稳定。 6、 用乙醇沉淀 DNA 寸，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀 DNAM，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc, Na+中和 DN 子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 7、 为什么在保存或抽提 DNA程中，一般采用 TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA

4、的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作 用。磷酸盐缓冲系统(pKa= 7.2 )和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生 理范围(pH)，可作 DN 卸保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2+产 生 Ca3(PO4)2 沉淀，在 DN 戒应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同， 有的要求 高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl (pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris ，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE缓冲液中的 EDT泌能稳定。 8、 STE是 Tr

5、is-Hcl 、EDTA Nacl 的混合液。其总体作用是为 DNAj供保护环境，在此环 境下 DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。 Tris.HCl 提供缓冲体系，DNAS这一体系中呈稳定态。 EDTA 是 DNAB的抑制剂，可以防止细胞破碎后 DNAB降解 DNA NaCl,有利于 DNA 的溶解。 9、 SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS(十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate ) 使 DNA 与蛋白质分离，在高温(55 65C)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，离心后除

6、 去沉淀， 10、 苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由 于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子 溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。 缺点：1.能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly (A) RNA 2.不能完全抑制 RNase的 活性。 Tris 酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。 11、氯仿的作用 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 (酚易溶于氯仿中)

7、 5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少 气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及 下层有机溶剂相维持稳定。 12、用乙醇沉淀 DNA 寸，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀 DNAM，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc, Na+中和 DN 子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 Tris 中文品名：三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；缓血酸胺 NH2 HO Tris 结构式 英文品名:Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminometha

8、ne 英文别名:2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol THAM; Tris base; Trometamol 通用 CAS : 77-86-1 产品纯度：100%(USP药典级)/ 99.9%(实验室技术级) 产品级别：USP药典级，符合 USP/EP/cGMP 寸药物赋形剂的要求 分子式：NH2C(CH2OH)3 分子量:121.14 使用用途：生物制药，体外诊断，个人护理及化妆品原料等 保存温度：常温密封避光保存 TRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成 PH值为 6.8 , 7.4 , 8.0 , 8.8。其 PH值随温度变 化很大。一般来说

9、，温度每升高一度， PH值下降 0.03。 1M TRIS-HCl 6.8 和 1.5M TRIS-HCl 8.8 是 SDS-PAGEt 常用的试剂。 而由 TRIS配成的 TAE TBE等是 DNA 电泳最常用的试剂， TE ( PH8.0)主要用于溶解 DNA TE为 Tris 加 EDT心称。 缓冲特性：Tris 为弱碱，在室温(25C)下，它的 pKa 为 8.1 ;根据缓冲理论，Tris 缓冲 液的有效缓冲范围在 pH7.0 到 9.2 之间。Tris 碱的水溶液 pH在 10.5 左右，一般加入盐酸 以调节 pH值至所需值，即可获得该 pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tri

10、s 的 pKa 的 影响。 衍生缓冲液： 由于 Tris 缓冲液为弱碱性溶液， DNA 在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。 人们常常在 Tris 盐酸缓冲液中加入 EDTA 制成“TE缓冲液”，TE缓冲液被用于 DNA 勺稳定 和储存。如果将调节 pH 值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE 缓冲液” (Tris/Acetate/EDTA ), 而换成硼酸则获得“ TBE缓冲液” (Tris/Borate/EDTA )。这两种缓冲液通常用于核酸电泳 实验中。 制备：Tris 可以由两步反应生成：先由硝基甲烷生成中间体三羟甲基硝基甲烷 (HOCH2)3CNO2，然后再由该中间体还原得到 Tris 。 用途：Tris 缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。