大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究

1、南 阳 理 工 学 院 本科生毕业论文 学院（系）： 生物与化学工程学院 专 业： 生 物 工 程 学 生： * 指导教师： 臧 晋（教 授） 完成日期 2012 年 5 月 南阳理工学院本科生毕业论文大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究Research of extraction and isolation of gardenia yellow pigment with absorption resin 总计： 毕业设计（论文）34页表 格： 28个插 图 ： 0幅南 阳 理 工 学 院 本 科 毕 业 设 计（论文）大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究Research of extract

2、ion and isolation of gardenia yellow pigment with absorption resin学 院（系）： 生物与化学工程学院 专 业： 生 物 工 程 学 生 姓 名： * 学 号： * 指 导 教 师（职称）： 臧 晋 （教授） 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 2012年5月 南阳理工学院 Nanyang Institute of Technology大孔吸附树脂分离提取栀子黄色素的研究大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究生物工程 *摘 要本文通过研究大孔吸附树脂对栀子黄色素、栀子苷的吸附与解吸条件而选择优化提取分离栀子黄色素的最佳条件。采用单因

3、素实验分别进行了色素吸附条件的选择，栀子苷洗脱条件的选择，并采用正交试验对色素洗脱条件进行了优化。实验结果表明：吸附效果最好的大孔树脂为HPD-100A型；大孔吸附树脂吸附色素的最佳条件为：树脂和栀子提取液的固液比为1：20(g/ml),温度为50，时间为20min，pH为8。色素吸附率可达93%；洗脱栀子苷的最佳条件为：浓度为5%的乙醇，洗脱7次后，对栀子苷的累积洗脱率为：96.1%；洗脱色素的最佳条件为：乙醇浓度90%温度为30时间为30min，色素洗脱率可达97%。关键词栀子黄色素；栀子苷；大孔吸附树脂；分离提取；条件优化。Research of Isolation and extrac

4、tion of gardenia yellow pigment with absorption resin Biological Engineering MA Cai-hongAbstract: In this paper, adsorption and desorption congditions of the yellow pigment and geniposide were studied, the purpose is to choose the best conditions to extract and separate gardenia yellow pigment. The

5、selection of adsorption conditions of pigment and desorption conditions of geniposide were studied by the single-factor test. And dsorption conditions of pigment were optimized by orthogonal test. Experiment shows：the best macroporuos resin is HPD-100A;the optimal condition that macorporous resin ab

6、sorp gardenia yellow pigment is: the ratio of resin and gardenia liquid is1:10,tempeture was 50,absorption time was 20min and the pH of gardenia liquid was 8;the absorption rate of pigment can be up to 93%. The optimal conditions to desorp geniposide with macroporous resin was: 5% ethanol, the cumul

7、ative desorption rate of geniposide is 96.1 after desorp 7 times.The optimal conditions to desorp pigment with resin was: the concentration of ethanol was 90%, desorption temperature was 30 and desorption time was 30min, and the desorption rate of pigment can be up to 97%.Key words: gardenia yellow

8、pigment; geniposide; the absorption resin; isolation and extraction; optimization. 29目 录1前言11.1 栀子概述11.2 栀子黄色素概况21.2.1 栀子黄色素的性质21.2.2栀子黄色素发生褪色和绿变的原因31.2.3栀子黄色素的提取31.3栀子黄色素提取分离研究现状及展望41.3.1 浸提工艺41.3.2 大孔树脂吸附法41.3.3 超临界流体萃取法51.3.4 微波提取法51.3.5 超声波法51.3.6 膜分离法61.3.7 植物酶处理法61.3.8 溶剂沉淀法61.4大孔吸附树脂61.4.1大孔吸

9、附树脂及其功能61.4.2大孔吸附树脂的预处理71.4.3大孔吸附树脂的再生71.5本文的研究目的意义与研究内容72.实验部分82.1材料与仪器82.11材料与试剂82.1.2仪器82.2实验方法92.2.1 栀子黄色素的提取92.2.2 树脂预处理和再生92.2.3大孔树脂吸附色素实验92.2.4洗脱栀子苷实验92.2.5洗脱栀子黄色素实验92.2.6实验数据处理102.3实验方案102.3.1大孔树脂吸附色素条件的选择102.3.2栀子苷洗脱条件的选择112.3.3栀子黄色素洗脱条件的选择122.4实验结果132.4.1大孔树脂吸附色素条件选择结果132.4.2栀子苷洗脱条件选择的结果15

10、2.4.3栀子黄色素洗脱条件选择的结果183 结论25参考文献26致谢271前言 合成色素具有品质均一、色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、易于溶解和着色等优点,从而被广泛应用于食品和化妆品等工业，但其没有营养价值，而且对人体有一定的负作用。天然色素与合成色素相比，有很多的优点。不但对人体无害，而且还有一定的营养价值，有些还对人体有医疗保健作用。因此寻找和开发更多的天然色素已成为食用色素发展的总趋势。栀子是提取天然色素的植物之一。别名黄栀子、山栀等，是一种常绿灌木，茜草科植物1。目前，栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第一批药食两用资源，具有护肝、镇静、止血、利胆、降压、消肿等作用，是生产“安宫牛

11、黄丸”、“龙胆泻肝丸”等几十种中成药的重要原料；还是提取食用色素添加剂“栀子黄色素”的优质材料,栀子黄色素一般为橙黄色粉末，其主要成分为藏红花素和藏红花酸，是一种罕见的水溶性类胡萝卜素，水溶液为柠檬黄色。稳定性好、着色力强、耐还原性、耐微生物性好，耐光、耐热，在pH值411范围内颜色基本不变，对金属离子稳定；对淀粉、蛋白质染色效果好而被广泛应用2。用于分离纯化栀子黄色素的方法有：水浸取法、大孔树脂吸附法、超临界流体萃取法、微波提取法、溶剂沉淀发、植物酶处理法、超声波法等1 -3。本文概括介绍栀子黄色素和大孔树脂分离提取栀子黄色素工艺条件的研究。首先选取了八种大孔吸附树脂对水提栀子黄色素的静态吸

12、附特性，从中筛选出一种吸附和洗脱性能较好的树脂，并对其分离纯化栀子黄色素的影响因素进行分析，目的在于改进黄色素的分离提取工艺，得到高色价，低OD值的纯度较高的栀子黄色素。1.1 栀子概述 栀子见于神农本经，是农胆目茜草科栀子属的一种常绿灌木，是卫生部颁发的第一批要是两用资源。据本草纲目等记载，栀子性苦寒、无毒，常用来清泻火、解玉支度等。栀子主产于福建、广西、四川、江西等省区,是喜温暖气候, 能耐旱、不耐寒的植物。对土壤要求不高，适宜在微酸或中性砂质壤土中生长，在山区、丘陵等地也都可栽种3 14。现代药理学研究表明，栀子具有清热、利胆、泻火、凉血、降压、止血、消肿等功效。医学上主要用来主治:黄疸

13、型肝炎，糖尿病、咽痛、高血压尿血、扭伤肿痛等4。黄栀子作为中药材，果实的各部分均可制药，对人体有医疗保健作用，是中药不可缺少的原材料，从黄栀子提取出来的栀子黄色素的主要成分为藏红花素和藏红花酸，是一种罕见的水溶性类胡萝卜素,极易被人体吸收，有保健作用，在人体内可以转化为维生素A。可以补充人体维生素的不足。因此研究栀子黄色素的分离提取非常重要。1.2 栀子黄色素概况 栀子黄色素是一种混合物，含有珍贵的水溶性类胡萝卜素、藏花素、藏花酸、栀子苷、绿原酸和黄铜等5。栀子黄色素的主要成分为藏花素和藏花酸。藏花酸为红棕色针状晶体、微臭、熔点180，易溶于热水和乙醇，是橙色溶液，水溶液呈弱酸性或中性，分子量

14、926.97 6。栀子分山栀子和水栀子，食品行业和医药行业对栀子的提取目的物不同，由于水栀子中藏花素含量较多，因此被应用于食品行业，中药主要提取栀子当中的环烯醚萜苷类化合物如栀子苷，羟异栀子苷等，这些物质清热泻火、凉血散瘀的功效。由于山栀子这些物质含量较高，因此中药中常选用山栀子作为原料7。总之由于栀子稳定性好、着色力强，耐还原性和耐微生物性好，而且耐光、耐热性也好，在pH值411范围内颜色基本不变，对金属离子稳定，对淀粉、蛋白质等的染色效果好而被广泛应用9。 1.2.1 栀子黄色素的性质栀子黄色素一般为橙黄色或深黄色粉末，水溶液为柠檬黄色。主要成分是a-藏花素（a-crocin）和藏花酸（c

15、rocetin），其中藏花素的化学式为CHO,分子量997.21，是胡萝卜素二酸雨右旋龙胆双糖成苷键相接，较稳定8。藏花酸，化学式为CHO，分子量为328.39，是胡萝卜素二羟酸，经实践研究栀子黄色素的最大吸收峰是440nm 10 。栀子黄色素中藏花素和藏花酸的结构式如下：图1 藏花素及其衍生物分子结构图2 藏花酸的结构式栀子黄色素易溶于水、乙醇等极性溶剂，难溶于苯、醚、汽油等非极性溶剂。由于栀子黄色素中的藏花酸为酸性成分，色素在碱性溶液中溶解度较大。紫外-可见光区内栀子黄色素水溶液有三个吸收峰： 440nm、238nm 、325 nm ，分别是藏花素和藏花酸、栀子苷、绿原酸特征吸收峰 9 。

16、是一种优良的天然植物色素，被广泛应用于食品、医疗和化妆品领域。栀子黄色素为天然食用着色剂,具有安全性好、色泽鲜艳、着色力强、使用方便等优点而被广泛应用为饮料、面制品、糖果、酒类、乳制品、化妆品的着色剂，同时也可用于中医药着色剂和中药材原料。栀子黄色素对淋病双球菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌、卡他球菌等有抑制作用，具有抗菌、抗病毒作用，是我国中药临床治疗黄疸型肝炎的最后好药物，具有利胆作用。日本、韩国、欧美等国外市场对栀子黄色素需求量很大，在国内,大型饮料厂为了增加产品的市场竞争力，也逐步使用食用天然色素代替食用合成色素 11 。目前, 我国对栀子黄色素的研究主要集中在栀子黄色素的一般性质上,

17、 对于栀子黄色素的精制纯化、功能特性以及栀子黄色素的研究则相对较少 7 。本文主要对栀子黄色素的静态提取工艺进行了深入研究，了解影响提取工艺的主要因素，为动态研究提供最好的工艺条件组合，以便得到质量较高的栀子黄色素产品，酸、碱、光、热和糖等对黄色素色调基本无影响。1.2.2栀子黄色素发生褪色和绿变的原因由于水提取的栀子溶液中有绿原酸等杂质，栀子黄色素易发生褪色、绿变等问题，限制了该色素的广泛应用。引起栀子黄色素绿变及褪色的原因主要有两个方面：一是栀子黄色素中存在易引起绿变的物质，栀子苷及绿原酸。栀子苷在蛋白酶或(- 葡萄糖苷酶)的作用下易发生反应而引起其着色的食品发生绿变，绿原酸则因易氧化而使

18、其着色的食品发暗。若把栀子黄色素中栀子苷的含量降低到一定含量，即可有效地防止绿变的发生。实践证明，当栀子黄色素中栀子苷的最大吸光度(吸收峰值在238nm处)与藏花素和藏花酸的最大吸光度(吸收峰值在440nm处)的比值小于0.4 时即可避免发生绿变 12。另外藏花素、藏花酸分子本身含有不饱和的多个共轭双键。通常调整酸碱pH至89 等方法可有效地防止褪色的发生；为了防止发生绿变，要提取栀子黄色素时，要使用新鲜的栀子果实，因为越新鲜的栀子藏红花素和藏红花酸的含量越高，栀子要晒干，提取液要洁净，尽可能降低栀子黄色素中栀子苷的含量才可避免。1.2.3栀子黄色素的提取栀子黄色素在水和乙醇溶液中的溶解性好，

19、同时存在的栀子苷类物质也极溶解于水。此外，栀子果实中还含有大量的果胶、蛋白、粘性物质等。据研究，醇有利于栀子黄色素的提取，而水则更利于栀子苷类的浸出。采用浓度较高的醇类物质提取栀子黄色素可提高栀子黄色素的提取率，同时可降低栀子苷和果胶等物质的溶出。有研究结果表明，用乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇等溶剂可使栀子黄有较大的提取率8 14。但考虑到经济因素及在食品行业中的安全要求，多用乙醇提取。但这种方法存在效率低、耗时长、品质不好、操作复杂等很多缺点或不便。研究栀子黄色素的提取工艺，提高色素纯度是本文研究的主要目的。1.3栀子黄色素提取分离研究现状近年全球市场对栀子的需求量逐年增长，我国是栀子产量较大

20、的国家之一，具有较大的开发发展潜力，自1961年日本就一直从我国进口栀子11 ，但我国栀子黄色素的提取工艺还是粗放型的，加工技术落后，开发利用度低。产品质量与国外有相当大的差距，目前我国还是主要研究传统的提取工艺条件和稳定性方面的研究，产品色价不高生产技术落后是我国栀子黄色素产业主要存在的问题。栀子黄色素是栀子深加工的主要产品之一，是一类珍贵的天然水溶性类胡萝卜素，无毒无臭食用安全，着色力好，应用范围广，成本较低，随着其需求量的逐年增长，备受关注。栀子在提取黄色素后，可从其废液中提取栀子苷和果胶，其废液还可以当做饲料,综合利用度高14。 我国采用膜技术对栀子黄色素进行分离纯化的研究取得了一定成

21、果，但依然处于初级阶段，没有进入实际应用。由于栀子黄色素的产品的精制至今没有得到解决，因此导致我国生产的栀子换色素色价过低，OD值高，所含杂质多，平直达不到国际标准水平。只能以原料或半成品的形式对外出口，大大降低了利润。因此，利用我国盛产栀子的优势，借鉴目前已有工艺，寻找合理高效分离提取栀子黄色素的方法很有研究价值。简化工艺降低成本，开发出具有实际可行的生产工艺，寻求适合工业化连续生产的技术路线。目前用于分离提取以及纯化栀子黄色素的主要工艺方法主要有：浸提工艺当大孔树脂吸附法超零界流体萃取法微波提取法超声波法膜分离法植物酶处理法溶剂沉淀发等。1.3.1 浸提工艺 如前所述，栀子黄色素是水溶性类

22、胡萝卜素，易溶于水和醇，传统的提取工艺大都为水和醇浸提法，即通过粉碎脱脂浸提过滤浓缩等步骤，提取20 %50 %的浆液，再经干燥得到栀子黄色素，该方法具有工艺简单、投资少、生产成本较低等优点，但该法生产的色素纯度低，质量差，难以精制，使用价值不大15。由于栀子黄色素与栀子苷都易溶于水和醇,为了得到纯度较好的色素，国内外大都采用了乙醇浸提，或先由水浸提后再经乙醇等予以分离纯化。一般而言，用乙醇为提取液相对于用水作为提取液来说，所提取的色素纯度较高 14。1.3.2 大孔树脂吸附法吸附树脂是近20年发展起来的一类新型非离子型有机高分子聚合物吸附剂，它具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，不受无机物存

23、在的影响，再生简便，分离性能优良，溶剂用量少，解吸条件温和，可重复使用，溶剂用量少等诸多优点，避免了用有机溶剂提取分离造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点15- 18。 其原理是通过物理是被吸附物质与大孔树脂见形成范德华力和氢键，通过有选择的吸附有机物质，从而达到提取分离的目的。采用大孔吸附树脂柱层析是目前分离天然产物栀子黄色素的主要方法之一，以大孔树脂为吸附剂，用静态吸附法选择出吸附和洗脱的最佳条件，再用动态柱层析，得到的栀子黄色素一般杂质含量低，纯度高，可以精制达到食用要求。1.3.3 超临界流体萃取法超临界流体萃取是食品工业中兴起的一项提取和分离技术，它是

24、利用液体在超临界区域兼有气液两性的特点和对溶质溶解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变化这一特性而实现溶质溶解与分离的一项技术17。利用这种超临界流体可从多种液态或固态混合物中萃取出需要分离的成分，一般采用CO2 作为萃取剂。超临界CO2 提取技术是以液态CO2 为溶剂进行提取的，其提取率与提取温度、提取压力、CO2 消耗量等因素有关。此技术操作工艺比较简单，没有有机溶剂残留，操作条件温和，栀子黄色素主要成分栀子苷和藏花素均易溶于水，极性较大，根据相似相容原理，它们在非极性的CO2 中溶解度很小，因此，可以用相应的萃取条件萃取栀子黄色素19。1.3.4 微波提取法微波法是一种非电离的电磁辐

25、射，是利用微波能量来提高萃取率的新技术。其本质是微波对提取溶剂和物料的加热作用。被提取的极性分子在微波磁场中快速转向和定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦，引起发热，提取速率高于常规加热法，易于提取物溶出和释放。该技术具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分回收率高，减少原料预处理费并对环境无害。微波射线穿透性极好，可施加于任何天然生物材料，在接近环境温度下抽提所需的有效成分，对于热敏性成分的提取极为有效，而且还可将其与超临界流体提取结合运用。微波提取方法的优点是提取率高、准确、快速、操作成本低。姚中铭等采用微波法，得到最佳的提取条件是：提取功率：210W，500g/L乙醇水溶液为提取溶剂

26、，提取时间为：80s，提取级数为2级，料液比1：12，色素提取率达到98.2% 20。 1.3.5 超声波法 超声波作为一种新的应用技术，近年来广泛应用于天然植物的提取。主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于所要提取的有效成分的溶出和释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本维持在57，对原料有水浴作用，与传统方法相比，具有提取速度快、时间短、收率高、不需要加热等优点。与微波法相比，超声波提取法提取时间相对较长，但是产品的质量优于微波法提取。因此，用超声波法提取天然色素有时间短，提取率高，得到的产品质量好，原料利用率高等优点。陆伟，钱骅等通过正交试验，确

27、定了超声波法提取栀子黄色素的最佳工艺条件为：乙醇溶液60%、温度45提取时间20min21。1.3.6 膜分离法膜分离技术最主要的是膜材料的选择，超滤膜对不同物质的截留性能的大小主要取决于膜材料的分子量的大小、形状、柔韧性和表面化学性质。这种方法是利用具有一定孔径的膜，根据其对不同分子量的物质有不同的截留性质而达到分离的方法1。对于特定的分离物需要选择不同材料，不同孔径的膜。膜分离程序为：栀子果实干燥预处理粉碎浸提离心过滤超滤精制超滤浓缩真空浓缩成品。膜分离技术具有过程较简单、无污染、没有相变、分离选择性好、经济性较好、可在常温下连续操作等优点，特别适用于热敏性物质的处理22。对于天然植物提取

28、物可避免加热浓缩和有机溶剂的使用，以保证提取的天然色素的品质。1.3.7 植物酶处理法利用特定的植物酶对栀子提取液中所含杂质的水解作用来去除杂质，从而达到精制的目的，栀子果实先用酒精提取，然后用一种蛋白酶（菠萝蛋白酶）分解，最后用常规的方法结晶，能得到叫纯的栀子黄色素1。1.3.8 溶剂沉淀法这种方法主要是在栀子黄色素半成品中加入一定量的酒精或其它一些有机溶剂，把色素萃取出来，而果胶栀子苷绿原酸等杂质沉淀下来，从而达到分离精制栀子黄色素的目的。这种方法对果胶的去除效果较好，但对栀子苷的去除率不理想，还需要经过酸碱处理1。1.4大孔吸附树脂1.4.1大孔吸附树脂及其功能 大孔吸附树脂是近10年发

29、展起来的一类大孔径的有机高分子聚合物吸附剂，被吸附成分在大孔树脂上的吸附是大孔树脂与有效成分形成以范德华力和氢键为主的分子间作用力的结果。15大孔树脂依据其聚合物的单体组成不同，可以分成非极性和极性两大类。非极性吸附树脂适合从极性溶液中吸附非极性物质；中等极性树脂可从极性溶液中吸附非极性物质，还能从非极性溶液中吸附极性物质；极性大孔树脂适合从非极性溶液中吸附极性物质。它具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，不受无机物存在的影响，再生简便，解吸条件温和，使用周期长，易于构成闭路循环，节省费用等诸多优点，避免了用有机溶剂提取分离造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点16

30、 -18。大孔树脂的孔径和比表面积是影响大孔树脂对物质的吸附的主要因素。大孔树脂比表面积越大，单位质量大孔树脂吸附的作用面积越大，单位质量大孔树脂吸附的有效成分就越多。而大孔树脂的比表面积还包括内孔网的面积。树脂孔径过小有效成分分子不能进入树脂内部，只能在树脂外表面吸附，相应的比表面积就比较小。因此选择的时候应该根据目标物的分子量选择合适孔径的树脂才能使吸附的有效面积增大。选择适合的树脂，采用合理的实验设计和工艺条件才能充分发挥大孔树脂的作用。要使大孔吸附树脂发挥最好的功能，需要正确选择大孔孔吸附树脂的吸附工艺，通常情况下，需要选择适合的上样液pH值、盐离子浓度吸附和洗脱温度、吸附和洗脱时间、

31、上样液浓度、吸附速率、洗脱剂浓度等工艺条件。1.4.2大孔吸附树脂的预处理大孔树脂字使用前需要进行预处理，能够使树脂发挥最好的作用。预处理的流程简述如下：（1）以10倍体积的乙醇浸泡树脂24h ；（2）用蒸馏水洗涤，将无水乙醇洗尽，抽滤至滤液无白色物质 ；（3）用5%的NaOH，10倍体积浸泡4h用蒸馏水洗涤，抽滤至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至ph接近中性；（4）用10倍体积的5%的盐酸浸泡1d，用蒸馏水洗涤，抽滤直至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至ph接近中性，备用。也可采用下列程序：在洁净的分离柱内，放入已去除外来杂质，体积恒定的大孔吸附树脂加入相当于树脂体积0.4-0.5倍的乙醇浸泡24

32、 h ，然后用树脂体积的2-3倍的乙醇与水交替反复洗脱交替洗脱2-3次，至最终以水洗脱后，保持分离使用前的状态。醇洗脱液加水不显混浊。也可用电导率、荧光和紫外吸收等作为前处理的标准。1.4.3大孔吸附树脂的再生使用过的大吸附树脂需要再生处理，以便再次使用，再生处理的过程简述如下：（1）将用过的树脂用高浓度乙醇浸泡，直至树脂颜色和新树脂接近（2用蒸馏水洗涤，将无水乙醇洗尽，抽滤至滤液无白色物质 （3）用5%的NaOH，10倍体积浸泡4h用蒸馏水洗涤，抽滤至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至ph接近中性（4）用10倍体积的5%的盐酸浸泡1d，用蒸馏水洗涤，抽滤直至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至pH接近

33、中性。1.5本文的研究目的意义与研究内容 随着食品工业的发展，食用色素的食用量越来越大，目前食品工业所用的添加色素大都为化学合成色素，化学合成色素存在许多缺点，不仅没有营养价值，对人体还存在许多潜在的危害，天然色素具有一定的营养和保健作用，因此天然色素在食品、医药和化妆品加工中的应用越来越重要1。栀子黄色素是一种重要的食品添加色素，随着国内国际市场对栀子黄色素需求的不断增加,栀子黄色素供不应求，价格逐年上升，栀子黄色素提纯工艺在近10年发展很快,但栀子黄色素在应用中易发生绿变和褪色12，因此各种分离纯化栀子黄色素的工艺研究具有一定价值。为了得到纯度较高的黄色素，本文选用了八种大孔吸附树脂进行试

34、验，选出对黄色素吸附性能较好的一种树脂，通过做用单因素实验，研究吸附时间，吸附温度，PH等因素对吸附性能的影响，的分离提取栀子黄色素的研究研究用乙醇做溶剂提取栀子黄色素，通过粉碎、脱脂、浸提、过滤、浓缩. 提取的浆料,再经干燥得到栀子黄色素，通过选择和优化栀子黄色素提取工艺条件，提高栀子黄色素提取率。采用单因素实验对栀子黄色素提取因素进行选择，通过正交实验对栀子黄色素提取工艺进行优化，从而确立最优提取工艺。本文研究用水做溶剂提取栀子黄色素，通过简单实验室条件和器材，选择出对黄色素吸附性能较好的树脂，并对其吸附和洗脱条件进行优化，为动态研究提供更好的工艺参数。首先，用选择的八种大孔吸附树脂吸附栀

35、子提取液，通过测定吸附前后栀子提取液的吸光值，计算吸附率和选择吸附性，从而根据实验结果选出一种吸附性能较好的树脂，本实验筛选的树脂是HPD-100A。其次，对HPD-100A吸附栀子黄色素的工艺条件，即固液比、吸附温度、吸附时间、提取液pH等进行研究，得出最佳吸附条件。再采用单因素试验分别进行了杂质栀子苷洗脱条件的选择和黄色素洗脱条件的选择，得出最好的杂质洗脱条件。最后采用正交试验对色素洗脱条件进行了优化。2.实验部分2.1材料与仪器2.1.1材料与试剂栀子干果:购于河南省南阳市张仲景药材市场。无水乙醇:购于南阳市天冠集团。蒸馏水正丁醇甲醇:南阳理工学院生化学院实验室。大孔树脂:HPD-100

36、AHPD-950D101AB-8ADS-17DM130ADS-7聚酰胺树脂:购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司。2.1.2仪器 电热恒温鼓风干燥箱 DH6-9146A型 上海精密实验设备有限公司紫外-可见分光光度计 UV2000 尤尼柯（上海）有限公司可见分光光度计 721 上海精密实验设备有限公司托盘天平 JA1003型 上海良平仪器制造有限公司电子天平 TGBA型 上海天平仪器厂循环多用泵 SHB-3型 郑州杜甫仪器厂恒温振荡器 2HWY-100C 上海智域分析仪器制造有限公司旋转蒸发仪 RE-52D 上海亚荣生化仪器厂离心机 TDL-40B 北京中光仪器仪表有限公司 粉碎机 FW-100

37、北京中兴伟业仪器有限公司2.2实验方法2.2.1 栀子黄色素的提取 取除霉烂的栀子果实，放入电热恒温鼓风干燥箱在50下干燥，粉碎，称取5栀子粉末，加入100ml水溶液，50恒温振荡提取，然后3500rpm离心15min， 取上清液抽滤即为栀子提取液，备用。 2.2.2 树脂预处理和再生将8种需要处理的树脂放入三角瓶中，加入10倍体积95%乙醇浸泡1d；用蒸馏水洗涤，将无水乙醇洗尽，抽滤至滤液无白色物质，然后用5%的NaOH，10倍体积浸泡4h用蒸馏水洗涤，抽滤至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至ph接近中性；再用10倍体积的5%的盐酸浸泡1d，用蒸馏水洗涤，抽滤直至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至p

38、h接近中性，备用 。2.2.3大孔树脂吸附色素实验用选择的八种大孔吸附树脂吸附栀子提取液，通过测定吸附前后栀子提取液的吸光值，计算吸附率和选择吸附性，从而根据实验结果选出一种吸附性能较好的树脂。采用单因素实验用筛选出来的大孔吸附树脂对栀子黄色素和栀子苷的吸附进行吸附条件的选择。主要的吸附条件包括固液比、吸附温度、吸附时间、栀子液pH等。2.2.4洗脱栀子苷实验由于实验中栀子液是用水提取的，吸附后栀子苷与色素尚未分开，需要进行栀子苷洗脱。实验中分别用0%、1%、2%、3%、4%的盐酸溶液、0%、1%、2%、3%、4%的氢氧化钠溶液和低浓度乙醇溶液对栀子苷进行洗脱，通过测洗脱后洗脱液的吸光值计算栀

39、子苷洗脱率，从而选出一种洗脱溶剂保证其对栀子苷洗脱效果好但不会将色素洗脱下来。实验步骤如下：（1） 固液比1:20制备400ml栀子水提取液。（2） 按最佳吸附条件进行树脂吸附色素，制备吸附色素树脂40g。（3） 洗脱实验条件选择试验2.2.5洗脱栀子黄色素实验在实验中，把经过栀子苷洗脱的吸附树脂再进行黄色素的洗脱，先通过单因素实验研究各洗脱条件对洗脱效果的影响，再设计合适的正交实验对黄色素洗脱条件进行优化。选出洗脱条件的最佳组合。2.2.6实验数据处理 本实验通过测定栀子黄色素和栀子苷的吸光值来进行数据计算，将所测溶液稀释一定倍数用可见分光光度计在440nm下测黄色素的吸光值，用紫外-可见分

40、光光度计在238nm下测栀子苷的吸光值，数据处理公式如下： OD=A/A E=A×稀释倍数 栀子黄色素的吸附率=×100%栀子苷的吸附率= ×100%选择吸附性R=栀子黄色素解吸率=栀子苷解吸率=式中， 黄色素色价； 吸附前黄色素的吸光值； 吸附后黄色素的吸光值； 吸附前栀子苷的吸光值； 吸附后栀子苷的吸光值； 解吸后黄色素的吸光值； 解吸后栀子苷的吸光值； 各溶液稀释倍数。2.3实验方案2.3.1大孔树脂吸附色素条件的选择（1）树脂种类的选择 大孔吸附树脂对不同的物质具有不同的吸附性能，通过测树脂对栀子黄色素的吸附率，来研究树脂对色素的吸附性能，从而选择合适的树

41、脂分离色素。本实验选用了八种不同的大孔吸附树脂，经预处理后，准确称取树脂各3.00g分别置于八只250ml三角瓶中，再分别加入栀子黄色素提取液30ml，置于水浴振动器中，在30，120r/min的条件下振荡3h后，离心，采用分光光度法，测定溶液吸附前后在440nm和238nm处的吸光值，计算吸附率和选择吸附性，结果见实验结果中表1。（2）最佳固液比的选择分别称取1g、1.5g2.0g2.5g3.0g预处理后的树脂于五只250ml的三角瓶中，再分别加入30ml栀子提取溶液，置于恒温振动器中，30，120r/min的条件下振荡2h后，离心，采用分光光度法，测定溶液吸附前后在440nm和238nm处

42、的吸光值，结果见实验结果中表2。（3）最佳吸附时间的选择称取5.0g预处理好的HPD-100A树脂，置于250ml三角瓶中，加60ml栀子提取液，30，120r/min的条件下在恒温水浴振动器中恒温振荡，定时取样测定上清液中残余栀子液在440nm和238nm处最大吸光值，结果见实验结果中表3。（4）最佳吸附温度的选择：大孔树脂吸附过程一般为放热过程，升高温度会降低吸附量，因而需要考察温度对树脂的吸附性能的影响，称取与处理好的树脂5份，每份3g，置于五只250ml三角瓶中，加入30ml栀子色素粗提取溶液，分别放在在25、30、35、40、45、的恒温水浴振动器中，在 120r/min的条件下振荡

43、40min后，过滤，采用分光光度法，测定溶液吸附前后在440nm和238nm处的吸光值，实验及计算结果见实验结果中表4。（5）初提液pH值对树脂吸附性能的影响 取一定量黄色素提取液，每份30ml，分别置于五只250ml三角瓶中，分别用柠檬酸-磷酸氢纳缓冲液调节pH值为3,4,5,6,7,8。称取备用的大孔树脂5份，每份3.0g。分别加入各个三角瓶中，35，120r/min条件下在恒温振动器中恒温振荡40min后，离心，测吸附前后色素溶液在440nm处和238nm处的吸光度值。测定及计算结果记入表5。2.3.2栀子苷洗脱条件的选择（1）不同浓度盐酸洗脱实验：配置浓度分别为0%、1%、2%、3%、

44、4%的盐酸溶液；取五只250ml的洁净三角瓶，分别加入2g吸附后的树脂，再依次加入20ml浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%的盐酸溶液。35，120r/min条件下，在恒温水浴振荡器中振荡10min后，静置，取洗脱液稀释10倍在440nm处测吸光值，稀释50倍在238处测紫外吸光值，并计算色素洗脱率和栀子苷洗脱率，结果见实验结果中表6。（2）不同浓度氢氧化钠洗脱实验：先配置浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%的NaOH溶液备用。取洁净的250ml三角瓶五只，分别加入2g吸附后的树脂，各量取0%、 1%、2%、3%、4%的NaOH溶液20ml分别加入三角瓶中，35，120r/min条件下，

45、在恒温水浴振荡器中振荡10min后，静置，取洗脱液稀释10倍在440nm处测黄色素吸光值，稀释50倍在238处测栀子苷吸光值，并计算色素洗脱率和栀子苷洗脱率，结果见实验结果中表7。（3）低浓度乙醇洗脱实验：先配置浓度为5%、10%、15%、20%、25%乙醇溶液，备用。取洁净的250ml三角瓶五只，分别加入2g吸附好的树脂，各量取5%、10% 15%、20%、25%、的乙醇溶液20ml分别加入三角瓶中，35，120r/min条件下，在恒温水浴振荡器中振荡10min后，静置，取洗脱液稀释10倍在440nm处测吸光值，稀释50倍在238处测紫外吸光值，并计算色素洗脱率和栀子苷洗脱率，结果见实验结果

46、中表8。（4）1%盐酸洗脱次数实验：取5g吸附好的树脂于干净的250ml三角瓶中，加入1%的HCL溶液50ml，35，120r/min条件下，在恒温水浴振荡器中振荡10min后，静置，取洗脱液稀释10倍在440nm处黄色素的吸光值，稀释50倍在238处测栀子苷吸光值，洗至洗脱液的吸光值不再变化为止，结果见实验结果中表9。（5）5%乙醇洗脱次数实验：称取5g吸附好的树脂于干净的250ml三角瓶中，加入5%的乙醇溶液50ml，35，120r/min条件下，在恒温水浴振荡器中振荡10min后，静置，取洗脱液稀释10倍在440nm处测黄色素吸光值，稀释50倍在238处测栀子苷吸光值，洗至洗脱液的吸光值

47、不再变化为止，结果见实验结果中表10。（6）将洗完杂质的树脂进行黄色素的洗脱，这样得到的黄色素纯度相对较高，本实验将用1%的盐酸和5%的乙醇洗完杂质的树脂再用90%的乙醇进行黄色素的洗脱，实验所测得的数据及计算结果见实验结果中表11。2.3.3栀子黄色素洗脱条件的选择（1）不同溶剂对栀子黄色素的洗脱效果 取已吸附栀子黄色素的HPD100A型树脂放入三角瓶中，分别加入10倍体积的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷在水浴振荡器中30，120r/min恒温振荡3h后离心，取滤液测定440nm处的吸光值，结果见实验结果中表12。（2）不同乙醇浓度对栀子黄色素洗脱效果的影响分别采用不同浓度的乙醇水溶液

48、作为洗脱剂，对已达到吸附平衡的树脂进行洗脱，分别称取5份已吸附平衡的树脂，每份3g，置250ml三角瓶中，分别加入不同浓度的乙醇溶液30ml，在水浴振荡器中，30，120r/min恒温振荡3h后，离心，取滤液测定440nm处的吸光度，结果见实验结果中表13。（3）洗脱时间对栀子黄色素洗脱效果的影响称取已吸附平衡的树脂5g置于250ml三角瓶中，再加入10倍体积的乙醇洗脱液，在水浴振荡器中，振荡5min后静置，吸取洗脱液稀释50倍，测其在440nm处的吸光度，再将三角瓶置于恒温振荡器中按上述步骤分别在10min、20min、30min、60min、120min后测定相应的吸光值。结果见实验结果中

49、表14。（4）洗脱温度对栀子黄色素洗脱效果的影响将已吸附平衡的树脂置于五只250ml三角瓶中，加入10倍体积的乙醇洗脱液，在恒温水浴振荡器中分别在25、30、35、40、45°C下振荡10min后离心，取滤液测定洗脱液在440nm处的吸光度，结果见实验结果中表15。（5）洗脱液pH对洗脱效果的影响取五只洁净的三角瓶编号，分别加入pH值为4、5、6、7、8的90%的乙醇溶液30ml，再分别加入已吸附后的树脂3g，40，120r/min条件下，在恒温水浴锅中振荡10min后,取滤液测定其在440nm处的吸光度，结果见实验结果中表16。 (6)洗脱次数与洗脱率之间的关系称取5g已吸附平衡的

50、树脂置于250ml三角瓶中，加入10倍体积的90%乙醇洗脱液，40，120r/min条件下，在恒温水浴振荡器中振荡10min后静置，取滤液测定440nm处的吸光度，将离心后的树脂加入50ml，90%乙醇，按上述步骤再进行洗脱，洗脱次数与洗脱率间的关系见实验结果中表17。（7）正交试验优化实验条件选择乙醇浓度、时间、温度、pH四个因素，其中pH作为误差项，做四因素三水平正交实验,选出洗脱栀子黄色素的最佳条件组合，为动态洗脱实验提供工艺参考值。具体实验方案及正交表见实验结果中表18和表19。2.4实验结果2.4.1大孔树脂吸附色素条件选择结果（1）树脂种类选择的实验结果根据实验方案中的步骤所测的栀

51、子提取液在吸附前后的栀子黄色素和栀子苷的吸光值以及吸附率和选择吸附性见表1。表1 不同树脂对栀子黄色素和栀子苷吸附率的影响树脂类型吸附前 吸附后 吸附率/% 选择吸附性 A D A D A D A D RHPD-950ADS-17DM130ADS-7HPD-100AAB-8D101聚酰胺0.539 50 2.118 50 0.195 10 0.207 50 12.7 90.5 0.2610.539 50 2.118 50 0.338 10 0.516 50 87.5 79.6 0.2970.539 50 2.118 50 0.201 10 0.437 50 92.5 82.5 0.2860.5

52、39 50 2.118 50 0.207 10 0.655 50 92.3 80.0 0.2940.539 50 2.118 50 0.040 10 0.617 50 92.9 80.2 0.2950.539 50 2.118 50 0.244 10 0.348 50 91.0 84.9 0.2730.539 50 2.118 50 0.239 10 0.578 50 91.1 80.2 0.2890.539 50 2.118 50 0.245 10 1.456 50 90.9 79.6 0.291注：上表中D为溶液稀释倍数根据表1中数据，应该选择对黄色素吸附能力强而对栀子苷吸附能力小的树脂，即大，小，且R大的树脂。由表中的结果可得，所选树脂中，大孔树脂HPD-100A对黄色素的吸附能力最大，吸附率为：92.9%，且其R值大，故选此树脂比较适合。（2）最佳固液比的选择的结果按照实验方案中所述步骤，通过实验所测得的数据及吸附率和选择吸附性的计算结果见表2。表2 树脂量对栀子黄色素栀子和苷吸附率的影响固液比/(g/m