高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量

1、反相高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量白祖海，文刚，张艳长沙市疾病预防控制中心，长沙 410001 )摘要：采用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇含量。以聚酰胺柱对样品进行预处理，排除其它成分的干扰，获得较好分离度和高回收率。选用自填装ODS-C 18色谱柱(200 mm X4.6 mm , 5 阿)，以乙醇-水(2 : 3,v/v)作流动相，流速为0.6 ml/min，紫外光检测波长304nm，柱温为25 C。白藜芦酵在0.05-0.40 pg/mL范围内具有良好的线性关系。r=0.9996，平均回收率为 98.51%(n=5) 。结论：该方法简便、准确可靠，适合于中药材虎杖中白藜芦醇含量的测

2、定。关键词：白藜芦醇；虎杖；反相高效液相色谱法Determination of Resveratrol in the Polygonum Cuspidatum byReversed-Phase HPLCBAI Zu-hai, WEN Gang, ZHANG Yan(Changsha Municipal Center for Prevention and Control of Diseases, Changsha 410001,China)Abstract ： A simple and sensitive Reversed-Phase HPLC method for the determinat

3、ion of resveratrol in the roots of Polygonum cuspidatum was described ，including the pretreatment of samples by poamide colutah. The separation wasPerformed on an ODS column(200 mm >4.6 mm，5 p m) with the mobile phase ofCH3CH2OH-H2O (2： 3,v/v).The flow rate 0.6 ml/min and the detection wavelength

4、 was 304 nm, the temp erature of the p illar is in door temp erature. Resveratrol have good linear relationship in the range of 0.05-0.40 卩 g (r=0.9996).The average recoveries(n=5)of resveratrol were98.51%.A simpie, accurate and sensitive method with good reproduciability to determine resveratrol si

5、multaneously in Polygonum cus pidatum Sieb.et Zucc.is establishedKeywords : Resveratrol; P olygo num cus pi datum； Reversed-P has曲 PLC.虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc是蓼科蓼属植物，广泛分布于华东、中南、辽陕甘川滇等地。虎杖根茎中主要含有蒽醌类和芪类化合物，其中芪类成收稿日期：2011-09-28修订日期：2012-07-20作者简介：白祖海（1978 ），男，湖南岳阳人，长沙市疾病预防控制中心，主管检验师，硕士学位分白

6、藜芦醇（resveratrol和白藜芦醇苷（piceid），具有活血定痛、清热利湿、止咳 化痰作用。白藜芦醇具有抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗菌、调节脂类代 谢、保护心血管系统和神经系统等多种功能 ，被列为抗心血管病、抗癌最有前 途的药物之一。虎杖中白藜芦醇含量最高3。目前对白藜芦醇的测定方法不少4,5，主要有分光光度法、胶束薄层色谱法7、电化学发光法8、高速逆流色谱法8-9、高效液相色谱法10-11等。建立准确可靠和简便的测定虎杖中白藜芦醇的含量方法对于虎杖资源的充分开发利用产生重要的实际意义，为其研究开发提 供科学的依据。本研究对虎杖样品进行初步处理，以乙醇 -水为流动相，建立了测定虎杖中

7、白藜芦醇的反相高效液相色谱方法， 该测定方法操作简单，测定结果 稳疋可靠。1 实验部分1.1 仪器与试剂HLPC Pump 装柱机（ BT3020 ，德国）；高效液相色谱仪（安捷伦， 1200系列，美国）,RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；WF-4000微波系统（上 海屹尧分析仪器有限公司）；高频数控超声波发生器 （KQ80TDB 型, 昆山市超 声仪器有限公司 ）, FA2104 型电子天平。乙醇（色谱纯，湖南师大试剂厂 ）；乙醇 （化学纯，湖南师大试剂厂 ）；乙酸乙酯（分析纯，和氏璧化工）；白藜芦醇对照品 （美国 Sigma 公司，纯度 99）；虎杖药材购自湖南九芝堂药材公司。

8、1.2 溶液的制备1.2.1 对照品溶液的配制称取白藜芦醇 2.5 mg ，置 25ml 容量瓶中， 乙醇溶解， 并稀释至刻度。 摇匀， 得含白藜芦醇 0.10 mg/ml 的混合对照品储备液，冷藏备用。1.2.2 虎杖的预处理根据虎杖中自藜芦醇、 白藜芦醇苷和大黄素的结构和性质的差异， 采用乙 醇溶液超声提取，利用极性适中的乙酸乙酯再提取，三种组分的回收率比较高。提取结果表明：采用乙醇超声初提取和乙酸乙酯二次提取比单独采用乙醇浸提或 回流提取的回收率高。 如最后采用氯仿提取， 乳化现象较严重， 且结果与乙酸乙 酯提取相比较差。 可以同时测定白藜芦醇、 白藜芦醇苷和大黄素的含量， 并防止 白藜

9、芦醇苷水解。1.2.3 样品溶液的制备本实验采用常规的加热回流方法提取白藜芦醇来建立标准曲线：虎杖粉末过4 0目筛，精密称取虎杖粉末5 0 g，用95%乙醇水浴回流提取三次，第一次用 250ml乙醇回流提取3h，第二、三次分别用200ml乙醇回流提取各Ih，合并提取液，冷却，过滤，滤液减压浓缩至月50ml后加蒸馏水200 ml，水浴挥发去残余乙醇,保温30min后过滤。滤液上聚酰胺柱，大量蒸馏水冲至无色后，用10%乙醇冲洗, 待颜色冲淡后用3 0%乙醇冲洗，收集30%乙醇冲洗液，减压蒸馏浓缩并定容于 100 ml容量瓶中，精密吸取上述溶液l ml，置10ml容量瓶中，乙醇稀释至刻度。为了对比常

10、规的加热回流方法提取白藜芦醇提取率的不同，本文还采用微波 法来提取白藜芦醇：虎杖粉末预处理后过 40目筛，精密称取虎杖粉末5 0 g，用95%乙醇浸泡1h后，在功率600W下微波处理5次，每次1min ,间歇时间为2min ,使提取温度不超过30oC。微波处理后余下的步骤与加热回流方法一致。图1白藜芦醇对照品和样品液相色谱图Fig. 1 HPLC chromatograms for standard resveratrol and extraction solution of Polygonum cuspidatum2 结果与讨论2.1 色谱条件色谱柱：选用0DS-C18色谱柱(200 mm

11、X4.6 mm , 5阿)；流动相：乙醇-水(2:3，V/V);流速：0.6 ml min-1 ;检测波长：304 nm ;柱温为室温；进样量10 M。在此条件下，作白藜芦醇对照品色谱图。样品溶液以相同条件进样，根据对照品白藜芦醇的保留时间初步确定样品溶液中白藜芦醇的特征峰。 白藜芦醇的 出峰时间为 3.05min ，与其他组分的色谱峰可以达到基线分离。此条件下白藜芦 醇的理论塔板数均不低于 3000 。对照品及样品液相色谱图见图 1。2.2 标准曲线的绘制精密吸取混合对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，置10ml容量瓶中,乙醇稀释至刻度，制成不同浓度的混合对照品溶液。按

12、“2.2色谱条件”测定峰面积积分值，以峰面积积分值丫为纵坐标，对照品进样量X为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，计算回归方程。白藜芦醇的线性回归方程及相关系数为：丫= 9.464X10 -5X+ 0.225式中，X为白藜芦酸质量浓度，单位为卩g/mL ; 丫为色谱峰面积，单位为 mm 2，线性回归系数 r=0.9996 ，最小检出限为 10ng/mL 。试验结果表明，白藜 芦醇在0.05-0.40 ug/ml范围内呈良好的线性关系。2.3 虎杖中白藜芦醇含量测定对同一批药材精密称取 5份，按2.1 溶液配制方法制备样品溶液。 将制备好的 待测溶液按上述色谱条件进样，根据峰面积计算该样品溶液中白

13、藜芦醇的含量。计算公式为n=(a/b) X100%。其中n为白藜芦醇的含量(g) ； a为白藜芦醇质量（g） ； b为虎杖粗粉的质量（g）。计算平均值得到虎杖中白藜芦醇的含量为0.3500% (见表 1)。表1虎杖中白藜芦醇含量的测定序号加入量（g）白藜芦醇（%）120.00250.3501220.04720.3496320.03650.3502419.98940.3498520.01480.3504Tab. 1 Determ in ati on of Resveratrol in the Po lyg onum Cusp idatum2.4加样加标回收试验依次配制白藜芦醇对照品溶液、样品溶液

14、和样品加对照品溶液,按上述方法测定其含量。将所得的5份供试品溶液按“色谱条件”项下进行测定,每份样品测定5次，计算加样回收率。测得平均回收率为 98.51% ;相对误差(RSD)为0.2279%，回收效果很好（见表2）。表2回收率试验结果序号加入量（卩g）测得量（卩g）回收率（%）平均回收率相对误差13.203.1698.7527.407.3198.7898.51%0.2279%311.2011.0398.48Tab. 2 Result of recovery ratio16.2015.9798.5822.8022.3497.985个样2.5重复性试验精密称取样品5份，按上述方法制备样品溶液和

15、做液相色谱检测，计算品中虎杖中白藜芦醇的平均含量为0.3506%，相对误差RSD为2.56%。实验结果见表3。可以看出，检测结果表现出很好的重复性，实验误差在允许范围内。据此认为可将此法用于实际样品分析。表3重复性试验结果Tab. 3 Results of rep eatability test序号力卩入量（g）白藜芦醇（%）相对误差（RSD）120.02360.3485220.03250.35482.560%319.98970.3493420.00480.3509520.00420.34952.6稳定性试验及提取方法的影响2.6.1对同一供试品溶液在8 h之内每隔1 h测定峰面积，试验结果表

16、明。白藜芦醇色谱峰面积无明显变化，其峰面积积分值的相对误差RSD分别为1.196 %，表明样品的溶液稳定性很好。2.6.2由于白藜芦醇对光热较敏感易分解，用常规法提取时活性受影响，且提取率低，故采用微波提取法。微波提取是近年才发展起来的一项新技术，与常规提取相比，其最大特点是作用时间短、速度快、提取效率高、提取温度低（V45 C ）。微波用于虎杖白藜芦醇的提取，可最大限度地避免提取过程中受光、 热影响而分解，提取率大大提高。本实验在加热回流办法建立标准曲线的基础上， 采用微波提取法来提取白藜芦醇，来对比其与常规浸提法对白藜芦醇提取率的影响。表4为常规浸提法和微波法对白藜芦醇的提取对比。 可见微

17、波法对白藜芦醇的提取具有效率和得率高的优点。表4提取方法对虎杖鲜根茎白藜芦醇提取率的影响Table 4 In flue nee of extract ion method for resveratrol on yield提取方法提取时间（min ）提取温度C）提取物中白藜芦醇含量得率（%）常规浸提法60450.3212%80.24微波法5400.3546%96.282.7结论2.7.1虎杖成分极其复杂12,不经预处理难以获得理想的分离效果，从而影响白藜芦醇含量测定结果的准确性。本文采用聚酰胺柱子预处理提取液成功地排除了其它组分的干扰，再进行HPLC检测，获得较好的分离度，且回收率高，因此本法可

18、用作虎杖中自藜芦醇含量的分析检测方法。2.7.2测定结果表明，虎杖中自藜芦醇含量可高达 0.3500%，我国虎杖资源十分丰富，虎杖可作为白藜芦醇提取的主要原料。2.7.3 乙腈具有较强的毒性，对环境和试验人员造成一定的伤害。本研究改选用无污染的乙醇-水体系，试验结果证明，本研究建立的HPLC法，样品经过预处理,为测定中草药及其相关产品中白藜芦醇提供了可靠的测定方法。 该测定方法灵敏度高、重复性好、 简便实用， 为虎杖和含白藜芦醇类中成药的有效成分的质量评价和控制提供了快速分析方法 。参考文献 :1 yoshlyuki kimuLa,Chohachi Konno,Masayasu Kimura.

19、 New constituent of rootsof Polygonum cuspidatumJ.Planta Med,l983,48(3):l64-1692Yoshiyuki Kimura,Sakuji Ko. Effects of stilbene componentsof roots ofPolygonum cuspidatum on liver injury in peroxidized oil-fedratsJ.PlantaMed,1983,48(1):51-54.3GANINI S J,HIRNTHI J,EUNG S L,et a1.Kinase inhibitors fromPolygonumcuspidatumJ. J Nat Prod.,1993,56(10):l805-l810.4石明睿 .虎杖中白藜芦醇提取、纯化生产工艺的研究D. 湖南中医药大学 ,2008.朱鸿津.HPLC法测定虎杖中白藜芦醇的含