医院细胞遗传室人羊水细胞培养及染色体制备作业指导书

1、医院细胞遗传室人羊水细胞培养及染色体制备作业指导书1 目的规范羊水标本细胞培养及染色体制备过程，为临床羊水细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。2 测定方法CO2培养/ 手工收获。3 测定原理人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可分为以下三类：上皮细胞（E） 、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF） 。 E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。AF细胞在培养初期就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F 细胞在培养中的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后

2、3-4 天（可能更早些）即出现 E 细胞的集落，它们不适合作染色体分析。大约在第7 天出现的AF 细胞可用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。4 性能特征经 G显带处理后可见300-550 条显带。5 样本类型及受检者准备在无菌条件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入15ml次性离心管中，约抽30ml，立即送检。6 试剂6.1 完全培养基100ml：在超净工作台内，用移液管将培养基和其他各试剂分装入100 毫升无菌瓶中（商业化培养基或 F10 培养基 70ml，胎牛血清30ml，双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml， 用 3.5%碳酸氢钠调节

3、pH为 7.2-7.4 ） 。6.2 秋水仙素浓度：20g/ml 。6.3 低渗液：0.075mol/L的 KCl 溶液6.4 卡诺固定液6.5 0.25% EDTA-trypsin6.6 生理盐水7 仪器及耗材酒精灯，烧杯，天平，离心机，CO2培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml） ，离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。8 操作程序8.1 细胞接种与培养8.1.1 在无菌条件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入15ml一次性离心管中，约抽30ml，立即送检。8.1.2 以 1500rpm 离心10min。8.1.3 进接种培养室，在超净工作台上吸去上清液，每管

4、约留 0.5ml ， 吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml 完全培养基入管内，吸管充分混匀，移至25cm2方形培养瓶中，置含5%CO2的 37温箱行开放式培养。8.1.4 一般 5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细 胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48 小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04 -0.08 g/ml, （ 1ml 注射器垂直加20 g/ml 秋水仙素2 滴 ）4-6 小时左右后行细胞学处理。8.2 细胞收获8.2.1 倒出瓶中细胞上清液入10ml 离心管中，生理盐水冲洗培

5、养瓶细胞面两遍。8.2.2 使用 0.25% EDTA-trypsin 消化 3-5 分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液或完全培养基终止消化。8.2.3 收集细胞悬液：离心，1500rpm， 10min，去上清。8.2.4 低渗：加入0.075M KCl 4-6ml ，吸管吹打，37水浴3-5min 。8.2.5 预固定：加入1.5ml 固定剂，轻混匀37水浴5min，离心 ,1500rpm,10min8.2.6 固定：去上清，加入固定剂8ml 左右，轻混匀，37水浴10min。8.2.7 室温 1500rpm 离心 10min，去上清，约留0.5ml 。8.2.

6、8 重复固定：同第7 步。8.2.9 离心， 1500rpm， 10min，去上清。8.2.10 根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定剂。8.2.11 滴片：每片1-2 滴。8.2.12 烤片： 75烤箱烘烤3小时。8.2.13 第二天行显带处理，详见7.1 。9 参考范围9.1 染色体数目：46,XN ；9.2 染色体结构：无明显结构异常。10 潜在变异来源10.1 不排除细胞培养过程中发生突变的可能性，从而导致染色体数目或结构改变，因此应严格执行2-3 线平行操作，以发现因培养过程导致的结果异常。10.2 羊水标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验人员收到羊水后应先观察羊水是否清亮，

7、含胎脂的多少及是否为血性羊水；羊水中少量红细胞不需处理, 如有明显血性羊水, 立即在羊水中加入无菌肝素一滴。10.3 接种所用器皿要进行严格的灭菌处理。10.4 离心时，一定要注意离心机内温度，必须达到室温方可离心。10.5 培养基pH为7.2-7.4 也是羊水细胞开放式培养成功的关键，而密闭培养的pH为 6.8-7.0 。10.6 注意接种时培养基不能加得过多，卧倒瓶子时，培养基不能接触瓶盖；10.7 羊水培养首先必须有好的培养基，传统的培养基是在F10中加入一定比例的胎牛血清, 由于营养成份较少, 羊水细胞培养所需时间较长, 培养成功率低。目前大多数实验室已经采用商业化培养基（必须具备三证

8、），稳定且重复性好。10.8 要根据细胞的生长状况，来决定所要收获的时间。抓住细胞生长旺盛时期相当重要，如羊水为血性羊水或胎脂较多需给予不同的处理。要收获较多的分裂相, 必须在适当的时机收获。收获标准：于 10 倍目镜和4 倍物镜下观察:以梭长形羊水细胞（AF 细胞 ） 为主要类型的生长细胞, 形成的细胞克隆覆盖1 个或 1 个以上的完整视野。培养瓶中有2 3 个以上细胞克隆, 且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞。细胞克隆中央的细胞开始老化, 克隆周边细胞生长旺盛。10.9 收获细胞时要掌握好低渗时间及低渗液的量，吹打时力度要均匀，滴片浓度不能太高，以免染色体不分散。培养收获时间大多数为8 9 天 , 最早收获在第7 天 , 最长 14天。显带时，胰酶消化时间一般比外周血要稍短，但需根据其胰酶活性而定。11 环境和安全控制11.1 试剂