胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化率的影响ppt课件

1、 研讨背景： 糖尿病diabets mellitus,是危害人类安康的重要疾病之一，胰岛移植已成为治愈型和部分型糖尿病的有效途径。但胰岛移植使胰岛供体短缺的矛盾日渐突出，制约了其在糖尿病治疗领域的临床运用。因此，寻觅可替代的其它来源的胰岛细胞成为近年研讨的热点，而干细胞诱导分化为胰岛细胞是最重要的研讨方向之一如何诱导胰腺导管干细胞分化为可本身合成胰岛素的前体细胞，目前尚无稳定的诱导方案目前，成体胰腺导管干细胞特性已得到证明，并曾经经过诱导获得胰岛样构造假说：胰腺导管干细胞与胰岛混合培育可提高胰腺导管干细胞向前体细胞的转化率，其作用与细胞角蛋白-19CK-19的表达亲密相关。目的：研讨胰腺导管干

2、细胞与胰岛混合培育对添加胎鼠胰腺干细胞向前体细胞转化率的作用及机制 研讨内容：分为胰腺导管干细胞单独培育组组，胰岛单独培育组组及干细胞胰岛混合培育组组。型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后，运用FICOLL-400梯度离心法纯化胰岛；采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺导管干细胞进展培育，经过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法，检测CK-19、巢蛋白、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培育基中参与纯化的胰岛进展混合培育，经过察看干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。 实验资料与主要试剂25mL 细胞培育瓶、24孔板,ficoll-400;-巯基乙醇、型胶原酶、HEPES、丫啶橙碘化丙锭A

3、O/PI、0.25%胰酶-EDTAsigma；RPMI1640培育基、低糖和高糖DMEM 培育基、胎牛血清 FBS 、牛血洁白蛋白BSA、Trizol、表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、尼克酰胺；兔抗大鼠巢蛋白抗体、山羊抗大鼠CK-19抗体、小鼠抗大鼠胰岛素抗体、小鼠抗大鼠胰高血糖素抗体;山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗山羊FITC荧光抗体北京中杉金桥生物技术；双硫腙DZT为上海试剂三厂产品；RT-PCR试剂盒，大鼠胰岛素ELISA试剂盒。 实验动物40只wistar大鼠，周龄，体质量250300，雌雄不限；20只孕14的wistar大鼠，体质量500550。 方法：1.实验分组本

4、实验共分为胰腺导管干细胞单独培育组组，胰岛单独培育组组及干细胞胰岛混合培育组组。各培育组细胞来源样本数均为个，各样本的细胞均来自不同的实验动物个体。 2. 成年大鼠胰岛的分别、纯化与培育取成年wistar大鼠，麻醉后取上腹部肋缘下横切口，丝线结扎胆总管入十二指肠处，胆总管内插管，逆行向胆总管内灌注0.8g/L的胶原酶-10mL，分别胰腺置于胶原酶-溶液中 0.8g/L ，38水浴静止消化17min取出后震荡15s，60目筛网筛过后参与含10%FBS的Hanks液终止消化，1000r/min离心2min，洗涤遍。沉淀参与4mL25%的Ficoll溶液重悬，依次参与23%、20%、11%的Fico

5、ll溶液，、3000rpm离心20min。搜集23% 20%界面和20% 11%界面的细胞悬液，并参与含10%FBS的 Hanks液，、 1000rpm离心，洗涤遍。手工挑拣直径大于100的胰岛，悬浮于有RPMI1640培育液含105u/L 青霉素、100g/L 链霉素、20mmol/LHEPES,15%FBS的24孔板中，每孔胰岛50个，37、5%CO2培育箱培育，隔日半量换液。 3. 胰岛细胞产量、纯度和存活率计算以及生物学活性鉴定 DTZ染色法计算产量及纯度；AO/PI荧光染色计算存活率； 在培育的第113天，测定培育液中的胰岛素程度； 在胰岛培育的第3、5和10天，分别测定低糖及高糖刺

6、激下的培育物胰岛素释放程度，同时计算胰岛刺激指数。 4. 胰腺导管干细胞的体外分别、培育、鉴定与诱导分化取孕14d的wistar大鼠腹中胎鼠的胰芽，胶原酶消化法获得原代细胞，置于含10% FBS的高糖DEME培育基中，待细胞生长铺满平底后以1:3传代，取第代细胞行CK-19、巢蛋白、胰高血糖素和胰岛素免疫组织化学及RT-PCR检测。 相关检测证明细胞胰腺导管干细胞相关标志物阳性后，改用含10% FBS 、 b-FGF(20ug/L、EGF(20ug/L以及1%尼克酰胺的高糖DMEM 培育基进展诱导。 5. 胰岛与胰岛干细胞的混合培育干细胞胰岛混合培育组的干细胞在改换诱导培育基的同时向培育板中参

7、与50个孔手工分拣的胰岛直径100um。6胰腺导管干细胞的鉴定及其诱导分化率的比较1-检测胰腺导管干细胞标志物基因的表达Trizol提取诱导分化前的第代胰腺导管干细胞总，按照逆转录试剂盒的阐明将逆转录成cDNA。将反转录产物稀释到10uL并取10uL进展PCR扩增，反响体系为50uL。反响条件：94 预变性3min，93 30s，5630，72 1min，循环30次，72再延伸7min1.5%琼脂糖凝胶电泳察看结果。各引物序列、估计产物长度和退火温度见下表。诱导分化后，再次检测胰腺导管干细胞标志物基因的表达。 (2)免疫荧光细胞化学染色取诱导分化前的第2代胰腺导管上皮干细胞以1105个孔铺96

8、孔板，待细胞交融达80%,吸去培育液，PBS冲洗次；以多聚甲醛溶液固定1015min，用PBS冲洗次；加0.3 Triton-100，室温放置15min，PBS冲洗次；加 BSA，放湿盒内封锁30min；吸去BSA，各孔滴加稀释的一抗稀释，放冰箱过夜后冲洗次；加荧光标志二抗，放湿盒中，避光孵育30min，PBS冲洗次。空白对照组以PBS替代一抗，其他条件与上述一样。各抗体浓度见下表。诱导分化后，再次检测以上目的。 7.统计学处置采用SPSS13.10统计软件进展两个样本的检验分析及反复丈量设计的方差分析，以a=0.05作为检验水准。 : :胰岛干细胞共培育第天；：胰岛干细胞共培育第胰岛干细胞共

9、培育第天；：胰岛干细胞共培育第天；：胰腺干细胞诱导前；：胰腺干细胞诱导培育第天；：天；：胰腺干细胞诱导前；：胰腺干细胞诱导培育第天；：胰腺干细胞诱导培育第天；：胰腺干细胞诱导培育第天胰腺干细胞诱导培育第天；：胰腺干细胞诱导培育第天 DTZ染色显示，胰岛细胞形状完好呈猩红色。每只胰腺可获得胰岛细胞34538个。Ficoll纯化后获得25442个胰岛细胞，平均纯度为8713%，平均回收率为74.3%。AO/PI染色后显示，胰岛制备物存活率大于95%胰岛单独培育组第天胰岛素分泌达峰值，随后下降，第天，胰岛素分泌量约降为最高值的。干细胞胰岛混合培育组胰岛素程度在第天到达峰值，但下降速度较慢，第天仍维持在峰值程度的左右。两组第9,11,13天差别有统计学意义0.05。干细胞单独培育组培育液中未检出胰岛素分泌。根底胰岛素程度 除第天胰岛单独培育组的高糖及低糖刺激下胰岛素分泌量无统计学差别外0.05，其他各组内同日低糖与高糖刺激下胰岛素分泌量的差别均有统计学意义均0.05。干细胞单独培育组培育液中未测出胰岛素。：CK-；：巢蛋白：胰高血糖素；：胰岛素 诱导分化前，胰腺导管干细胞同时表达-、巢蛋白及胰高血糖素，但不表达胰岛素。诱导分化后，干细胞单独培育组和干细胞胰岛混合培育组中除上述目的继续表达外，胰岛素也开场表达：CK-19 ：巢蛋白：胰高血糖素：胰岛素胰腺导管干细