胶回收DNA注意事项

1、胶回收DNA考前须知1切胶回收 DNA 片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。 所以为了减少胶的体积，我们 就可以用相比照拟薄的胶来跑电泳， 通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回 收试剂引起的一些后续麻烦。2主要还是 DNA 的浓度，如果 DNA 浓度不够，想胶小点也不可能。3紫外灯下切下含待回收 DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜， 使用无 DNA 污染的新刀片， 其目的在于防止外源 DNA 的污染。4利用凝胶回收试剂盒 DNA 回收效率较低或者未回收到目的片段可 能有以下几个原因：胶块未完 全溶解，可适当延长水浴时间，并增 加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积

2、太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液 pH 太高，硅基质膜在高盐低 pH 结合 DNA,如 pH 太高，应作适当调整；漂洗液中未参加无水乙醇。5可以改用去离子水洗脱。 但是实验室所用纯水一般 pH 偏低， 可利 用 NaOH适当调高其 pH 值，以增加洗脱得率。6洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除 漂洗缓冲液，具体方法参见回收 效率低的解决方案。7不可以使用更小洗脱体积小于说明书提供的最小洗脱体积进 行洗脱以提高浓度，因为说明书 提供的最少洗脱体积是能完全覆盖 吸附膜的最小体积，假设减少体积那么不能将 DNA 完全洗脱下来。8电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶

3、回收试剂盒。如果后续 实验对片段纯度要求较高，建议 即使只有一条带，也可以切胶纯化, 其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。9琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的 片段的凝胶再空气中放置过久， 使胶块失水、 枯燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在 4C 或-20C ;制胶的电泳缓冲液浓度过高 或陈旧。关于胶回收切胶的一点考前须知1. 电泳的 buffer 和 gel 都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna 污染。2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的 体积，可以用相比照拟薄的胶来做，只要够

4、点样即可，也可采用薄而 宽的梳子来跑胶。3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼 睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶 有特殊要求，例如要求不含 EB,可以采用点 marker 和带刻度的尺子 一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。4. 按照正常程序点 marker 跑胶，然后切下有 marker 的胶，EB 染色,紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker 间的相对位置已 知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如 果觉得很难判断，可以直接在 marker 边点少量的样，这样位置就容 易确定了。胶回收一. 提高

5、胶回收量的方法：1 增加电泳时的上样量。2 电泳缓冲液用新鲜配制的。3 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的 胶就不要要了，不然影响回收率。4 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转 移到同一个柱子上。5 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于 DNA 与膜的结合，不 过一般不要多余 750ul。6 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性电荷和疏 水性使 DNA 与柱子结合，因此，假设电泳缓冲液的 PH 偏高，可在溶胶 液中参加 10ul PH 5.0, 3mol/L 的 NaAQ ;为了使 DNA 分子更好 的 拦截在膜上，可以添加 30%异丙醇在

6、加热溶解胶后的液体里。7加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟大约需10 分钟，以使乙醇充分挥发。段最后少加些洗脱液， 尽量减少回收体积， 一般用 30-50 引洗脱液洗 脱 不能太少，否那么无法浸湿膜反而不利于洗脱；洗脱液滴在膜中 央，以充分洗脱结合在膜上的 DNA。9 可以在参加洗脱液之后，可以在 55 度水浴 5 分钟或放在 50 度水 浴 10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封 4 度过夜，第二天再离心回 收，效果不错。10将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。二. 几种 PCR 产物回收的详方法和步骤1 普通胶回收如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手 工回收，可以切

7、胶后参加 3 倍体积 TE,水浴熔化后，酚、酚/氯仿 抽提干净，乙醇沉淀 即可。另外好似还有冷冻法，没作过，不是很 清楚。2 从低熔点凝胶回收 DNA纯化 DNA 片段 加与凝胶体积相等的 TE 10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA，置 65C 水浴 5 分钟保温，使凝胶完全溶解。待放 至室温，加等量酚TE 饱和，TE 封在上层，取下层酚，轻轻混匀不 用混 匀，12000rpm, 3 分钟离心。反复 1-2 次。取上层液，力口 0.1 体积 3mol/L醋酸钠pH5.2和 2.5 倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。 将 纯化的 DNA加适量 TE 溶解，测定

8、含量，备用可用于目的基因 结构分析，探针制备等。3 扩增特异性好的 PCR 回收如果 PCRT 增特异性好，只是简单的 PCR 产物纯化回收，可以在 PCR 产物中参加 50ug/ml 的蛋白酶 K, 37 度 1h,酚/氯仿抽提一次，氯 仿抽提一次，上清参加 0.1 体积的醋酸钠，2.5 体积的无水乙醇沉淀 回收。三. 不需胶回收就可直接连接的方法 1低温冷冻析出法跑电泳时用低熔点的 agarose 胶，跑到一定时候，将目的条带所在的 那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的外表，并且，把 底下没有脱氧 核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入 1.5ml EP 管中， 然后放在负75 度冰箱

9、中 10-30 分钟，接着 1, 300rpm 离心 5- 10 分钟，取 10ul 上清，参加连接体系中。将其余的液体也吸出，储存 在 另一个管子中，做好标记，放在20 度备用。2酶切后的直接连接在你酶切后可以直接的参加连接酶和另外的片断进行连接是可以筛 选出连接好的片断的.四、一些考前须知1.电泳的 buffer 和 gel 都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好 洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源 DNA 污染。2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体 积，可以用相比照拟薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽 的梳子来跑胶。3.关于防护，在一般有机玻

10、璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛， 如果你戴树脂眼镜就可以了。4. 琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液， 保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓 冲环境中如果用 柱子的话。对于小于 1 0 0 b p 的片段回收，可 加至 30%#丙醇。5. 如果是用 PAGE收，用水或 TE 溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。 当然你要将 100bp 在胶中位置定好切下。已标记的探针用 X 片，未标记的用 EB6.选用回收效率较高的柱子，比方进口的 Qiaquick spin column7. 参照分子克隆 用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一 般凝胶可

11、用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法 回收 DNA片段。附注：1. 影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：1 DNA 分亍大小 迁移速率 U 与 logN 成反比N 为碱基对数目。分 子大小相等，电荷根本相等DNA 结构重复性。分子越大，迁移越 慢。等量的空间结构紧密的电泳快超 螺旋线性 DNA2 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U 为迁移率，U0 为 DNA 的 白由电泳迁移率，t 为胶浓度，Kr 为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度， 分辨不同范围的 DNAAgarose 0.5%: 1-30 kb; 0.7%: 0.8-12 kb1.2%: 0.4-7 kb; 1.5%: 0.2-3 kb.3 DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状 线状 DNA 律链开环。当条件 变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB 含量有关。4 所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm5 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 C6 嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率，不提倡加在电泳液中7电泳缓冲液 0.5 X TB 由勺组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率， 无离子存在时，核酸根本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶 并导