乳糖操纵子发现历程

1、 乳糖操纵子发现历程 本文是我在 2005 年为了给硕士生上课所整理的材料 已有知识背景 1927年H J Muller用X-光进行诱变 1941 年 George Beadle, E L Tatum 提出 one gene-one enzyme贸说 1944 年 Oswald Avery 等 证明基因是 DNA 1940年，Jacques Monod开始研究E.coli进行乳糖代谢的一些特征研究， 观 察到乳糖和其他半乳糖甘可以诱导 B-半乳糖甘酶的产生。他和MelvinCohn用抗 B-半乳糖甘酶抗体检测酶蛋白，发现诱导后酶量增加。 进一步研究发现事情更复杂。一些神秘的突变株“ crypt

2、ic mutants能产生 B-半乳糖甘酶，但是却不能在以乳糖为碳源的培养基中生长。这是什么原因呢 ? 为了答复这个问题， 他们用放射性标记的半乳糖苷进行研究。 发现野生型菌 在乳糖诱导后会摄取半乳糖苷，而这种突变型菌不能。 -Lactose +Lactose Wild strain - + Cryptic mutant - - 这个实验结果有什么提示呢？ 1在野生型菌中，有一种物质与B-半乳糖甘酶一起被诱导，它负责输送半 乳糖苷进入细胞。 2突变株中，这种物质的基因被破坏。 Monod 将这种物质命名为半乳糖苷透过酶。但为此他遭到了同事们的批评， 因为他在这个蛋白未别离到之前就进行命名。 M

3、onod 对当时的情形作了如下描 述： This attitude reminded me of that of two traditional English gentlemen who, even if they know each other well by name and by reputation, will not speak to each other before having been formally introduced. Monod 和同事努力别离纯化得到了半乳糖苷透过酶。在这个过程中，他们 还别离到了另一个蛋白：半乳糖甘转乙酰酶，该酶与 B-半乳糖甘酶和半乳糖甘 透

4、过酶一起被诱导。 这样，到了 50年代末， Monod 已经知道有三种酶共同被半乳糖苷诱导。他 们也发现了一些组成型突变株，不需要诱导就可以产生这三种酶。 Monod 认识 到用遗传学分析可以加快实验进展，所以与同在 Pasteu门nstitute工作的Francois Jacob开展了合作研究。 在 Arthur Pardee的协作下，Jacob和 Monod 构建了局部二倍体merodiploid, 携带着野生型和组成型的等位基因。 野生型等位基因证明是显性的。 野生型细胞 可以产生某种物质使lac基因关闭。这种物质也可以使组成型基因表达关闭，从 而局部二倍体也是诱导型的。这种物质他们命名

5、为 repressor组成型菌株的 repressor基因有缺陷Tt突变，即lacI-。 Jacob和Monod推测，repressor和某特定DNA序列结合。(称之为operator。 这种结合是特异的，基因突变会影响这种结合。 Operator的某些突变可以破坏它 和repressor之间的相互作用。这样也会导致组成型表达。那么，如何区别这两 种组成型突变呢 ? 他们俩想， 如果上述假设是正确的话， 那末就可以跟据这个突变是显性还是 隐性来进行区别。Jacob打了一个很形象的比喻。同样也要构建局部二倍体。他 把局部二倍体中的两个operator比作两个无线电接收器,分别控制进入一个房间 的

6、两扇门中的一扇。两个repress。嚓无线电发射器，发射同样的信号使门关闭。 如果一个repressor基因发生突变(不表达)，就像一个发射器坏了，另一个发 射器仍会工作，两扇门仍然是关闭的。换句话，二倍体中的两个 lac operon仍然 是阻遏的。这种突变是隐性的。 如果是一个operator发生了突变，就像一个接收器发生了故障，所控制的门 市开的。另一扇门的接收器是正常的，门仍然关闭。这样，突变的 lac operon仍 然是去阻遏的，表现为显性。这种突变叫顺式显性( cis-dominant)。 Operator 组成型用Oc表示。 在实验中， Monod 等还发现两个突变株，无论有无

7、诱导物存在都不表达 lac gene而且将该突变基因和野生型基因构成局部二倍体时，也表现出不表达 lac gene这种突变是显性的。这也是lacI基因的一种突变结果(lacIs),其产物可 以与operator结合，但不能与lactose结合。 另外，还有一种突变 lacI-d (dominant negative),不能与 operator结合。 Repressor-operat。旃目互作用的实验证明 Lac repressor1勺纯化 (1960s Walter Gilbert and Benno Muller-Hill) 在当时的条件要完成这件事是非常了不起的工作。 Represso质细

8、胞内含量 很低，而且没有简易的方法可以鉴定。当时最敏感的是用标记的合成诱导物 IPTG。但是，即使应用这种方法在野生型细胞的抽提液中也难以检测到 repressor 为了解决这个问题 Gilbert 等， 应用了突变株， lacIt， 其与 IPTG 结合更紧密。 这样突变的repressor可以结合足够的IPTG,来检测目的蛋白，即使在很不纯的 抽提物中。于是， Gilbert 就可以纯化该蛋白了。 在此根底上， Melvin Cohn 等用硝酸纤维素膜结合实验方法研究了 repressor 与operator的相互作用。ssDNA和蛋白质一DNA复合物可以与硝酸纤维素膜结 合，而dsDNA

9、不能。他们用32P标记Operator结果确实证明，repressor可以和 operator结合，而且IPTG可以抑制它们结合。组成型突变的0c与repressor的结 合能力大大降低。这个实验证明了 Jacob和Monod用遗传学方法确定的operator 确实是repressor的结合位点。 阻遏的机制 起初，人们认为repressor(RX以阻止RNAP与启动子(P)结合。 1971年，卜a Pastan等用实验证明即使有 R存在，RNAP也可以与lac P紧密 结 合。将RNAP与DNA 含有lacP、lacO以及R一起孵育，然后加诱导物IPTG 和rifampicin。如果未形成开

10、放型启动子复合物，rifampicin将会抑制转录。但是 转录确实发生了。说明 lacR 并没有阻止开放型启动子复合物的形成。所以， R 并不能阻止RNAP与lacP结合。实际上，RNAP与R可以同时与启动子结合。 那么， R 的阻遏机制是什么？ Barbara Krummel and Michael Chamberlin提出一种解释：R 阻断了起始转录 复合物向延伸状态的转变。 换句话说， R 把 RNAP 困在起始状态， 只能合成很短 的转录体。 Jookyung Lee and Alex Goldfarb 为这一解释提供了实验证据。应用了 run-off 转录方法，使用一旦123bp D

11、NA 含lac控制区和lacZ基因的起始局部。先 将R与DNA 一起孵育10min,让R-O结合。再加RNAP, 20min后让开放型 启动子复合物形成力口 heparin。Heparin能与游离的RNAP或与DNA结合不紧 密的 RNAP 结合， 抑制 RNAP 与启动子结合。 然后参加 RNAP 反响的其他成分， 但不包括CTP。5min后，参加a-32P-CTP及IPTG ,并设立不加IPTG对照。反 应 10min 后，通过电泳观察是否发生 run-off 转录。 实验结果显示，确实观察到了转录题。因此， R 不能抑制 RNAP 与 laP 之间 的紧密结合。 实际上lac操纵子有3个

12、operator。除了主要的O1,还有两个辅助的O, 一 个在上游，一个在下游，都与阻遏作用有关，但 O1 起主要作用。两个 O 之间可 以通过 R 相互作用。 Lac操纵子的正调控 当 E.coli 在含葡萄糖和乳糖的混合碳源培养基中生长时， 菌体首先利用葡萄 糖，仅当葡萄糖消耗完后才利用乳糖。在葡萄糖存在时，即使无阻遏物存在 lacI- , lac基因也不表达。 进一步研究说明，葡萄糖对lac基因表达的抑制是间接的，是葡萄糖的某些 代谢产物抑制了 lac基因表达，因此这种效应被称为代谢物阻遏效应catabolite repression。 无论真核生物还是原核生物， cAMP 对基因表达的

13、控制都具有普遍作用。 1958年，E. Sutherland在研究动物激素作用的过程中发现了 cAMP ,可以激 活糖原磷酸化酶1971年获nobel奖，cAMP由腺甘酸环化酶产生。ATP在腺 甘酸环化酶的作用下产生cAMP和PPi。一些激素，如肾上腺素，可以激活腺甘 酸环化酶。研究发现这个分子在体内有各种不同的功能。 Monod&Jacob 有句格言 aphorism what is true for Escherichia coli is true for the elephant 一些生化学家开始用细菌系统来说明 cAMP的功能。 Mackman&Sutherland 发

14、现在葡萄糖饥饿的 E.coli 细胞内 cAMP 含量上升。参加 葡萄糖后 cAMP 含量下降。 后来卜a Pastan等证明参加cAMP可以解除代谢物阻遏效应 包括lac、gal、 ara操纵子。那么cAMP是正调控因子吗？ (注：Pastan 1961年在NIH和Jim Field 一起研究甲状腺刺激激素(TSH) 的功能。 在Earl Stadtman实验室做了一段博士后，然后又转向研究 TSH。当时 Earl Sutherland已发现很多激素可以激活腺甘酸环化酶，从而增加胞内 cAMP水 平。这也启发Pastan研究起甲状腺中的cAMP水平的变化。他发现TSH也能激 活腺甘酸环化酶，

15、使组织内cAMP水平增加；而且，在组织内参加 cAMP的类 似物也能产生TSH的许多作用。指出cAMP是TSH作用的中介。那么cAMP是 怎样起作用的呢？他想也许通过对 E. coli的研究更容易找到答案。他和 Robert Perlman就开始一起研究。受Sutherland工作的启发，做了上述实验。) Geoffrey Zubay和Pastan两个小组几乎同时发现与 cAMP结合的蛋白。Zubay 称为 catabolite activator protein (CAP), Pastan称为 cAMP receptor protein(CRP), 其编码基因名称为crp。Pastan还测定了 cAMP-CAP的解离常数，为1-2M10-6M。 CAP作用机制 Zubay等发现一系列突变株，CAP和cAMP均不能促进其lac基因转录。突 变位点在lac启动子内，后来分子生物学家确定了 cap的结合位点就在lac启动 子的上游(Activatorsite) 。 Pastan等人证明CAP-cAMP与A位点结合后， 可帮 助RNAP形成开放性启动子复合物。(P188 Fig7