分子生物学技术(中国药科大学)

1、分子生物学技术克隆（clone）定义：广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组的后代的过程。在生物学上，是指选择性地复制出一段DNA序列（分子克隆）、细胞（细胞克隆）或是个体（个体克隆）。克隆技术又称为“生物放大技术”。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。命名方式：主要依据来源来定，一般

2、是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)，最后的序号用罗马字符表示第几个发现的。如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。限制与修饰系统（Restriction-modification system，R-M system）限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并

3、不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。限制性内切酶特异性识别位点限制酶识别的序列大多数为回文对称结构（palindromes），切割位点在 DNA 两条链相对称的位置；识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。不同的限制酶切割DNA位点的效率（frequency）不一样。切割DNA 的两条链，则产生平末端或粘性末

4、端。？同裂酶（isoschizomers）：识别位点相同，切割位点不一样。同尾酶（isocaudarner）：即能切割产生相同末端的限制性内切酶载体（vector ）：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。（目的基因无复制原点，不能自我复制）特点：自我复制、运载工具、多克隆位点、标记基因、安全性等。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒载体pBR322抗生素抗性基因：氨苄西林抗性和四环素抗性DNA复制起点：ori限制性酶切位点：EcoR1，Pst1，BamH1克隆过程：· pBR322质粒和目的基因· 使

5、用Pst1对质粒和目的基因酶切· 产生粘性末端（sticky ends）· DNA连接酶连接成环状基因· 导入细菌· 四环素抗性氨苄西林敏感筛选（外源DNA破坏了氨苄西林抗性基因）影印接种法(replica plating)具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每平板上的菌落控制在50300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的

6、菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的实验，目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。· 改进质粒PUC系列18/19，无四环素抗性基因，含有lac Z基因 LacZ基因（-半乳糖苷酶基因）包括：一段-半乳糖苷酶的启动子；编码肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。广泛用于基因表达调控研究中的一种基因，LacZ基因编码的beta一半乳糖普酶（简称beta-gal)是由4个亚基组成的四聚休，可催化乳糖的水解。Beta-gal比较稳定，用

7、X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察。LacZ基因是基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，-半乳糖甘酶显色反应选择法，即蓝白筛选。例如，基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。蓝白斑筛选蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这

8、种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化。转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。原理是细菌处于0， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化方法：电击

9、法 ( electroporation)、基因枪法(Biolistic-bombardment)等噬菌体载体主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。双链噬菌体为类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。用的噬菌体克隆载体主要有类噬菌体和M13噬菌体。与质粒相比，· 感染细胞效率更高· 克隆基因片段更长· 基因克隆不是细胞的复制，而是形成噬菌斑M13噬菌体载体特点：Lac Z基因、多克隆位点、单链DNA、可定点突变，感染大肠杆菌后变成双链复制形式。类噬菌体载体：构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体（ins

10、ertionvectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。另一种是替换型载体（rePlacementvectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。（有最短片段要求>=12kb，常用于构建基因文库）噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。柯斯质粒：柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，其特点：（1）具有噬菌体的特性（无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒）（2）具有质粒载体的特性 （3）具有高容量的克隆能力（插入的外源片段至少不能小于30 kb

11、）（4） 具有与同源序列的质粒重组的能力表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。有很强的启动子，核糖体结合位点靠近起始密码子。诱导表达载体：原核系统真核蛋白表达异常，因为· 诱导性启动子· 大量真核蛋白对原核生物有毒性· 干扰原核生物的正常生长· 无翻译后修饰· 表达蛋白形成包涵体，失活· 需要诱导物诱导表达（如IPTG）温度诱导型原核表达载体pBV220原理：PLPR启动子是大肠杆菌l噬菌体中控制早期转录的启动子，具有极强的起

12、始RNA转录的功能，基因工程中常用它来构建高效表达载体，它受抑制物CI蛋白的负调控。在实际中CI蛋白被改造成温度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp长）编码。CIts在30时具有抑制启动子的活性，在42时失活而失去抑制启动子的活性，因此，改变工程菌的培养温度即可控制目的基因的表达，这一点比用诱导剂诱导表达的系统要节省操作步骤和成本，在大规模基因表达中优点尤其明显。融合表达：在目的基因附近连接标签序列tag（便于纯化或检验），如连上六个组氨酸标签，用Ni亲和层析柱纯化得靶蛋白，用特异性酶切去组氨酸即可。 真核表达系统 正确折叠、已修饰、可溶性的蛋白。酵母细菌穿梭载体

13、3; 双宿主复制均可· 酵母的启动子和细菌的复制起点· 在酵母中表达· 具有蛋白折叠和糖基化作用· 分泌至胞外（有信号肽）杆状病毒载体（昆虫表达系统）· 启动子强· 基因组过大，用转移载体· 易发生同源重组Ti表达载体（tumor inducing植物载体）PCR（Polymerase chain reaction）· 对温度稳定的DNA聚合酶（Taq聚合酶，具有5-3聚合酶活性外切酶活性）· 含有酶切位点的引物· 温度循环变化，94变性解旋、55退火引物结合、72室温延伸RT-PCR：是将RN

14、A的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。互补DNA（Complementary DNA，cDNA）是一种利用逆转录酶，以RNA（通常是mRNA）为模板作成的复制品，经常用来将真核生物的基因（以mRNA形式）复制到原核生物细胞中。若一个cDNA含有许多来自

15、不同基因的mRNA，称为cDNA基因库（cDNA library）。重叠PCR(Overlap PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。不对称PCR(asymmetric PCR) 是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物（高浓度）与限制性引物（低浓度），其比例一般为501001。不对称PCR主

16、要为测序制备ss-DNA，尤为用c-DNA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。如TaqMan荧光探针，每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光。分子分离技术琼脂糖凝胶电泳（核酸分子的分离）· 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他

17、支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。· 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，小分子受到的阻力小。因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。核酸分子带负电，由负极运动到正极，故大分子靠近负极，小分子靠近正极。· 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。· 普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（蛋白分子

18、分离）· 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中以三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷· SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关二维聚丙烯凝胶电泳（蛋白分离，分辨率高）二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根

19、据蛋白质的大小进行分离）。通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（13 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30 min，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。离子交换层析（Ion Exchange Chromatograph）是以离子交

20、换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。分子检测技术放射自显影(autoradiography)（定量或定性）利用放射性同位素所发射出来的

21、带电离子(或粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。放射自显影的主要步骤包括：放射核素的标记、样品制备、核子乳胶膜的制备、自显影和显影及定影等。感光成像（Phosphorimaging）（定量更精确）表面涂有感光材料的纤维片（涤纶或醋酸纤维），经过照相机及其他光学曝光后在底片上形成潜影，在暗房经过显影液进行标准显影（药液的浓度、显影的温度、搅动的次数、显影的时间等都有一定的要求）后，再进行停显（一般用乙酸），最后是定影、水洗、烘干液体闪烁计数(liquid scinti

22、llation counting)是使用液体闪烁体（闪烁液）接受射线并转换成荧光光子的放射性计量方法。液体闪烁计数器主要测定发生核衰变的放射性核素，尤其对低能更为有效。非放射性示踪（Non-radioactive tracers）灵敏度高、污染小，如酶标探针。核酸杂交技术（Nucleic Acid Hybridization）定义：互补的核苷酸序列（DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等）通过Watson-Crick碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程，称为核酸分子杂交技术，又称核酸杂交。DNA印迹法（Southern Blots）Southern印迹法(So

23、uthern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。经碱处理凝胶使DNA变性（使双链DNA变成单链），通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，经过干燥或紫外线照射处理。单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上，转移后的单链DNA分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交。经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。（酶切、电泳、变性、结合、杂交、显影）DNA指纹(DNA fingerprint)指具

24、有完全个体特异的DNA多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，可用来进行个人识别及亲子鉴定，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"。(类似于Southern Blots)DNA分型（DNA typing）通过分子基因分型比较鉴定生物个体的一种DNA分析技术。用以进行比较的生物样品的DNA通过限制性核酸内切酶酶切、电泳分离和同位素标记的重复DNA杂交，可以提供对于每个个体特异的放射自显影带型。原位杂交（situ hybridization）以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原

25、位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。探针（常使用多聚核苷酸和抗体）多聚核苷酸探针：使用其它来源的同源基因，根据基因序列推测相应蛋白。应用：基因在染色体上的定位· 探针DNA偶脸上显影剂DNP· 染色体基因变性解螺旋· 杂交· 探针DNP端连接上第一抗体· 一抗

26、连接上另一带有荧光基团（FITC）的抗抗体· PI染色RNA印记（Northern Blots）将经过凝胶电泳分离的RNA转移到适当的微孔膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上的技术。膜上的RNA可再与标记的特异核酸探针杂交以分析特异性RNA。· RNA制备及样品处理· 电泳· 印记（转膜）· 与标记的DNA杂交· 定性检测DNA测序（DNA sequencing）Sanger双脱氧链终止法测序：根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，

27、然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP），ddNTP。自动测序法（Automated DNA sequencing）· 建立在sanger法的基础上· ddNTP标记有不同的荧光分子（四色荧光染料）· PCR产物为相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物· 绿色A，橘黄色G，红色T，蓝色CDNA测序的化学降解（切割）法（Maxam-Gilbert sequenci

28、ng）(1)先将DNA的末端之一进行标记，通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。限制性酶切图谱（Restriction maping）将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置，基本方法是用两种以上的限制性内切酶（如Pst1和HamH3）分别对目标DNA进行酶切，电泳检测片段的大小。定点突变技术（Site-directed Mutagenesis）通过聚合酶链

29、式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。（设计错配引物）PCR-based site-directed mutagenesis：· DNA变性变为单链· 连接突变引物（碱基错配）· PCR扩增几轮· 突变DNA的分离· Dpnl水解甲基化的GATC位点，以除去野生型DNA转录图谱（Mapping transcripts）利用表达序列标签（EST）作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱。定量图谱反映转录的速率。S1核酸酶图谱：用于定位5和3

30、端的mRNA的序列并定量分析RNA如内含子。基本过程是含P32DNA探针标记5端·和目标RNA杂交·S1核酸酶降解单链DNA或RNA·电泳分析片段长度。（如图3端测序）引物延伸· 除了mRAN的两端序列，还需获得中间的碱基序列· 设计引物与mRNA杂交· 使用逆转录酶合成cDNA完整序列· 变性处理反应混合物· 引物、延伸DNA进行电泳· 信号强度反映转录水平脱落转录（Run-off transcription）· 限制酶酶切后，随后进行转录分析，由于启动子下游的序列比较短，这样RNA聚合酶很快

31、就从模板上跑下来了· 是一种非常经典的检测启动子强度和转录起始位点的分子生物学实验方法· 把要检测的目的序列用限制性内切酶进行酶切，一个位点在启动子上游，一个在启动子下游，这样原先非常长的序列就变成了一小段序列。· 能与最短RNA片段杂交的是含有转录起点的DNA片段，能与最长RNA片段杂交的是含有转录终点的DNA，能与中长度RNA杂交的DNA片段位于转录起点和转录终点之间盒式转录（G-less cassette transcription）与脱落转录不同的是，不用酶切，在启动子下游的延伸序列的盒式结构缺少鸟嘌呤从而使转录终止，形成特定长度有的核苷酸片段，电泳检测。

32、转录速率的测定：转录产物RNA的浓度取决于合成速率和降解速率，其测定方法有细胞核连缀转录分析和报告基因转录法。连缀转录（Nuclear run-on transcription）从细胞内分离核子，并在胞外相关核素的标记下继续其转录过程。报告基因转录（Reporter gene transcription）：检测启动子活性的方法。报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。如编码氯霉素乙酰基转移酶（CAT）、半乳糖苷酶、荧光素酶等的基因。蛋白质印记法（western blot，Immunobloting）经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显