实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证

1、题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证实验目的:1. 学习目的基因连接转化载体的原理和方法。2. 学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。3. 学习菌落PCR鉴定阳性克隆的方法和步骤实验原理1. DNA的连接重组:具有相同粘性末端的两段 DNA分子在DNA连接酶的作用下可以连接在一起。因为相同的 粘性末端同一通过碱基互补配对形成一个相对稳定的结构。连接温度的选择，理论上的最适 温度是连接酶的最适温度-37摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对结构稳定，所以 在室温下（1216度）既可最大限度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。2. 感受态细胞的制备:将快

2、速生长的大肠杆菌置于经低温（0C）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞 膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分 核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易 与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如 Mn Co）、DMS（或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100 1000 倍。3. 质粒的导入在冰上融化感受态细胞，经过42度短暂热激后，由于细胞膜处于液晶态产生裂缝，外源DNA黏附于细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。然后将菌体放入适宜的培养基

3、中培养，以促进细胞的愈合恢复。4阳性转化的培养基筛选方法。普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有 Kana霉 素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳 性，故需要进行PCF鉴定。5.菌落PCR的原理通过目的基因的引物进行菌落 PCR如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过 PCF获 取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。从而将阳性与伪 阳性菌落区分开。三. 实验材料及设备1. 实验材料：(1) 已完成酶切的载体与目

4、的基因片段。DNA连接酶，缓冲液等。(2) 冰冻的感受态 DH5a大肠杆菌。2. 实验仪器：(1) 恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000卩L取液 器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；(2) 电泳仪，电泳槽，样品槽模板(梳子)，有机玻璃内槽，水平仪， 取液器，微波炉，凝胶成像系统。(3) PCR仪3.实验试剂：(1 )质粒的转化与转化导入a. DNA连接酶d.酶切后的pET28a、目的基因片段等。b. lOXbuffer;c. 卡那霉素；e丄B培养液:胰蛋白胨(Tryptone )10g,酵母提取物(Yeast extract )5g，NaCI5g，琼脂(固体培养基)1

5、5g，用 1N NaOH调 pH7.5;(2) DNA琼脂糖凝胶电泳检测a. Gold view( DNA染 料)b. 1 x TAE缓冲液c. 上样缓冲液(6x buffer )(3) PCRa. loading bufferb. 四种脱氧核糖核苷酸原料、Taq酶、上下游引物c. ddH2O四. 实验方法及步骤实验流程图离心收豪就陣TSmtco-a-CaCljPCR鉴定菌落载体质粒与目的基因连接转化1. 质粒的连接转化a）在EP管中分别配置下列的体系:0.2ml EP 管10X buffer2.5 yL酶切后的pET-28a7.5 yL酶切后的目的基因片段13 yLT4DNA连接酶（考虑连接

6、效率）2 y LX : 丫 = 1 : 1030,总体积25卩Lb）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱20 C下保存备用。22 C 反应 30min ,-2. 转化质粒的导入a）取出感受态细胞 DH5a让其在冰上自然解冻， 每100卩L解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。b）42 C热冲击45秒，立即置于冰浴5min。c）热激法：使用化学试剂（如 CaCI2）制备的感受态细胞，细胞膜 通透性发生变化，极易与外源DNA想粘附并在细胞表面形成脱氧核糖酸酶的羟基-磷酸钙复合物。此时，将该体系转移到420C下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈运动，并随机出 现许多间隙，

7、外源 DNA就可能被细胞吸收；d）冰浴过程中不要摇动 EP管；（使破裂的菌体自然恢复）e）再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37C摇床中培养1h。目的：使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；f）涂布于含有kana的LB固定培养基表面，37 C培养过夜3. PCR鉴定假阳性1.在0.2mL EP管内配制25卩L PCR反应体系1个:实验室没有MgCI2,但是Buffer 中含有Mg2+,所以实际添加 18.5+1.5=20 卩 L 的 ddH2O;PCR单管加样时，对于非常微量反应物体积（卩L）ddH2O18.510 x Buffer2.5MgCj 21.54

8、x dNTP1引物10.5引物20.5Taq酶0.5菌落挑1个的样品一定将样品加于管壁上或者液体中，防止漏样;加样的顺序：先加ddH2Q其次是缓冲液和菌落， 最后加酶，且要把 样品加到液面下，酶从-200C冰箱中拿出后放在冰中待用， 加酶时枪 尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓慢吹吸几次，保证足够的 酶量；2、用灭菌枪头挑单菌落（在培养皿背面做好标记）接触EP管内，混匀瞬时离心，每组可做5个体系。由于反应体系体积太小，引起的误差较大，可以一次配置多个（比所需反应体系个数多一个）反应体系，然后分开；3、放入PCR仪中，设置反应程序: 94 C预变性5min ; 94 C变性30S;使双链的DN

9、A模板解旋为单链； 55 C退火30S;引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 72 C延伸60S;Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按 5'一 3方向，复 制模板的互补链； 重复步骤30次；(1) 新合成的DNA分子可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目 的分子呈指数增长。(2) 一般进行30个循环，因为此时目的分子的扩增进入平台期； 72 C延伸10min;最后4C保藏。4. 跑胶验证：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1 X TAE缓冲液淹没 过胶板5mm用取液器将PCR产物5卩L与1卩L上样缓冲液（6 X ）混匀，加入胶板的样品小槽内。将电泳槽与电泳仪接通，

10、调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处，停止电泳。将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中 DNA存在处显示出荧光条带。五. 实验结果菌落生长情况: 可以看到，左侧的工程菌形成较多 菌落，而右侧几乎没有生长，两组工 程菌的差异主要在于热激时长（受 错误实验操作步骤影响，右侧实验 组2只热激了 20s，而左侧为正常 的 45s）菌落较小，且分布密集，说明菌液浓 度过高或者没有摇匀。图i平板工程菌生长情况(左实验组1右实验组2)PCR实验结果Marker:DL2000A 带：2000bpB 带 1000bpC 带

11、 750bpD 带 500bpF 带 250bpG 带 100bp图2菌落PCR凝胶电泳紫外荧光检测结果说明：泳道编号依次为：1红色荧光蛋白工程菌2绿色荧光蛋白工程菌3绿色荧光蛋白工程菌（老师提供），4 DL2000Maker所得条带较为清晰，部分呈现“ U型”可能是电压过高，胶板温 度过高。泳道123都产生了长度约800bp的条带，与预期结果较为接近， 且GFP组的分子量大于 RFP组，与事实一致。证明所验证的三个菌落 均为阳性菌落。老师所提供 GFP工程菌由于菌体较多，可见大肠杆菌 基因组条带（3条带1000bp到2000bp之间）泳道1的下方还出现了一条约 300bp的清晰条带，可能是引

12、物因 为巧合而PCR扩增出的杂带。六. 结果讨论与结论:1. 实验结论：通过DNA连接酶，我们将目的基因片段与载体质粒混合，再通过 热激发，我们成功将转化质粒导入DH5a,并用含有Kana霉素的固体LB培养基验证，证明所检测的三个菌落都不是假阳性。2. 讨论一：PCR一般循环重复2530次，重复次数过多会怎丿羊？答：溶重复次数过多，虽然在一定程度上能够提高产物量，但是由于反应时间过长，有一些非特异产物的扩增和碱基错配数也会相应增加；而且随着酶的扩增能力下降，合成目标片段的能力也会随之下降，也可能引起其他的非特异性扩增；此外还可能会 导致PCR反应“平台效应”的出现3. 讨论二：挑取单菌落的注意

13、事项有哪些？(1) 培养皿底部朝上，在酒精灯火焰20cm内操作;(2) 操作时不要讲话，在无风处操作；(3) 挑斑器具要求无菌;(4) 挑选远离群菌落的单菌落，菌落不要过大；4. 讨论三：2. Taq DNA聚合酶的特性和菌落 PCR的原理。Taq DNA聚合酶的特性：Taq DNApol具有5' 3'聚合酶活 性和3' 5'外切酶活性，但体外使用的 Taq酶无3' 5'外切 校正活性。Taq酶最大的特点是耐热性； 另外还具有高的催化合成 特性。菌落PCR的原理：直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，可以快速鉴定菌落是否为含有目的基因的阳性菌落，此per的方法通常被用来进行筛选插入的目的基因或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的片断大小。5. 讨论四：BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征， 用处。(1) DH5a和BL21都可以作为表达宿主。(2) BL21是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别， 在高密度发酵BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。(3) DH5a复