紫外可见分光光度计

1、第二章、紫外第二章、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 本章主要内容本章主要内容1、紫外-可见吸收光谱2、紫外-可见光度计仪器组成3、吸收光谱的测量- Lambert-Beer 定律4、分析条件选择5、UV-Vis分光光度法的应用 第一节、紫外第一节、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的选择性吸收特性。UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160780nm。紫外可见分子吸收光谱测定所用的仪器是紫外可见分光光度计，其测定波长范围为200 1000nm。UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，

2、尤其是有机化合物的重要定性工具之一。 第二节、光谱仪器第二节、光谱仪器 组成：组成： 1.光源； 2.单色器； 3.样品容器； 4.检测器（光电转换器）； 5.信号显示器（ 电子读出、数据处理及记录） 1、光源、光源 是一种有光谱特性的器件，理想的光源必须满足：在使用波长范围内有足够的辐射强度和良好的稳定性；辐射光是连续的，其强度不随波长的变化而发生明显的变化。常用的紫外光源是氢灯或氘灯，波长范围为160-375nm，同样条件下氘灯的辐射强度比氢灯大4倍左右。常用的可见光源为钨灯或碘钨灯，使用的波长范围为3501000nm。近年来，碘钨灯因寿命长、强度大而代替了钨灯。2、分光系统、分光系统(单

3、色器单色器) 将由不同波长的“复合光”分开为一系列“单一”波长的“单色光”的器件。 理想的100%的单色光是不可能达到的，实际上只能获得的是具有一定“纯度”的单色光，即该“单色光具有一定的宽度（有效带宽）。 有效带宽越小，分析的灵敏度越高、选择性越好、分析物浓度与光学响应信号的线性相关性也越好。构成：狭缝、准直镜、棱镜或光栅、会聚透镜常用的色散元件有棱镜和光栅。商品仪器多选用光栅，因光栅可在整个波长区提供良好的均匀一致的分辨能力，而且成本低，便于保存。 入射狭缝入射狭缝准直镜准直镜物镜物镜棱镜棱镜焦面焦面出射狭缝出射狭缝f入射狭缝入射狭缝准直镜准直镜光栅光栅物镜物镜出射狭缝出射狭缝f其中最主要

4、的分光原件为棱镜和光栅。其中最主要的分光原件为棱镜和光栅。 3、吸收池、吸收池 除发射光谱外，其它光谱分析都需要吸收池。盛放 试样的吸收池由光透明材料制成。 石英或熔融石英：紫外光区可见光区3m； 玻璃：可见光区（350-1000nm）； 透明塑料：可见光区（350-1000nm）； 盐窗（NaCl晶体）：红外光区。4、光电转换器、光电转换器（1）光电转换器是将光辐射转化为可以测量的电信号的器件。（2）理想的光电转换器要求： 灵敏度高；S/N大；暗电流小； 响应快且在宽的波段内响应恒定。早期检测器早期检测器 人眼人眼(Vis)，相板及照像胶片相板及照像胶片(UV-Vis) UV-Vis 硒光电

5、池硒光电池（Photovoltaic cell, ,光伏管光伏管） 350-(500)max-750nm 真空光电管真空光电管（Vacuum phototube） 据光敏材料而定据光敏材料而定 光电倍增管光电倍增管（Photomultiplier tube） ibid 光电转换器光电转换器(photo transducer) 硅二极管硅二极管（Silicon diode） 190-1100nm UVUV- -V Vis 5、信号显示器、信号显示器 由检测器进行光电转换后，信号经适当放大，用记录仪进行记录或数字显示。目前国产许多紫外可见分光光度计的仪器都配置有工作站和激光打印机，测定信号的记录、

6、处理、打印操作都可以通过工作站的计算机进行控制，工作较方便。第三节、紫外第三节、紫外可见分光光度计可见分光光度计仪器的类型：按光学系统分为单波长和双波长1. 单波长分光光度计 单光束 双光束（空间分隔） 双光束（时间分隔）特点：双光束方法因光束几乎同时通过样品池和参比池， 因此可消除光源不稳产生的误差。 2. 双波长分光度计 特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数 光谱、不需参比液、克服了电源不稳而产生的误差，灵 敏度高。1单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计 单光束分光光度计只有一条光路，通过变换参比池 和样品池的位置，使它们分别进入光路进行测定。 首先用参比溶液调透光率10

7、0，然后对样品溶液测 量并读数。使用单光束分光光度计时，每换一次波长，要 用参比溶液校正透光率到100，才能对样品进行测定。 若要做紫外可见全谱区分析，则很麻烦，并且光源 强度不稳定会引入误差，此时可改用双光束分光光度计。2单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计 与单光束相似，不同的是在单色器与吸收池之间加了一个斩光器。把均匀的单色光变成频率、强度相同的交替光，一束通过参比溶液，另一束通过样品溶液，然后由检测器交替接收参比信号和样品信号，并把它们的差值转变为电信号，经放大后由显示系统显示出来。 双光束分光光度计适用于在宽的光谱区域内扫描复杂的吸收光谱图，但对生物样品等复杂的试样不易找到合

8、适的参比溶液。3双波长分光光度计双波长分光光度计 用两种不同的波长的单色光1、2交替照射试液，并被光电倍增管交替接收，测得的是扣除了背景干扰的吸光度之差的A0。 双波长测定法不用参比溶液，只用样品溶液即可完全扣除背景(包括溶液的浑浊、吸收池的误差)，大大提高了测定的准确度。 第四节、紫外第四节、紫外可见吸收光谱法的定量分析可见吸收光谱法的定量分析1 .Lambert-Beer 定律定律 当强度为I0的入射光束,通过装有均匀待测物的介质时，该光束将被部分吸收，未被吸收的光将透过待测物溶液。 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即。为摩尔吸光系数bcA2、朗伯、朗伯比尔

9、定律比尔定律 为摩尔吸光系数，仅与入射光的波长、被测组分的性质和温度有关，在一定条件下是被测物质的特征性常数。 值越大，吸光程度越大，定量测定时的灵敏度越高； 1.0 x104时为强吸收， =1.0 x1034为较强吸收， 1.0 x102为弱吸收；b为液层厚度，cm； c为被测组分的浓度。 说明：在一定条件下溶液的吸光度A与被测物质的浓度和液层厚度的乘积成正比。但必须满足入射光是单色光、被照射物质是均匀的非散射性物质等条件。bcA3、 紫外紫外可见吸收光谱法的定量分析可见吸收光谱法的定量分析（1） 单组份定量方法 1）标准曲线法 2）标准对比法：是标准曲线法的简化，即只配制一个 浓度为标准溶

10、液，并测量其吸光度，求出吸收系数k， 然后由Ax=kcx求出cx（2）多组分定量方法 吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个 组份。 （3）双波长法： 当混合物的吸收曲线重迭时，可利用双波长法来测定。第五节、紫外第五节、紫外可见吸收光谱分析实验技术可见吸收光谱分析实验技术 当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移， 因此需要对其进行校正。 波长标度校正： 使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。 吸光度标度校正： 采用 K2CrO4 标准液校正（在25C时，于不同波长处测定0.04000g/L的 KOH 溶液（0.05mol/L）的

11、吸光度 A，调整光度计使其A 达到标准吸光度。1 仪器测量条件仪器测量条件 由于光源不稳定性、读数不准等常带来误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.151.00范围内。入射光波长的选择 为使测定有较高的灵敏度，应选择max作为入射光，但要注意max所在的波峰不能太尖锐，这样由波长不准确或非单色光引起偏离朗伯比尔定律的程度较小，测定结果较准确。 如果有干扰物质存在，应根据“干扰最小，吸收较大”的原则选择入射光。2 反应条件选择反应条件选择显色剂的选择原则： 使配合物吸收系数 最大、配合物稳 定、与配合物吸收波长相差大等。 显色剂用量： 配位数

12、与显色剂用量有关 溶液酸度： 配位数和水解等与 pH 有关。 显色时间、温度、放置时间等。3 参比液选择参比液选择 用适当的参比溶液在一定的入射光波长下调节A=0，可以消除由比色皿、显色剂、溶剂和试剂对待测组分的干扰。 当显色剂、试剂在测定波长下均无吸收时，用纯溶剂(或H20)作参比溶液，称溶剂空白； 若显色剂和其他试剂无吸收，而共存的其他离子有吸收，则用不加显色剂的试液为参比溶液，称为“样品空白” ； 当试剂、显色剂有吸收而试液无色时，以不加试液的试剂、显色剂按照操作步骤配成参比溶液，称为试剂空白。 总之，要求用参比溶液调A=0后，测得被测组分的吸光度与其浓度的关系符合朗伯比尔定律。 4 吸

13、光度范围的选择吸光度范围的选择由计算可知，当透光率T为0.37即吸光度为0.43时，浓度测量的相对误差最小；当透光率T为0.650.15即吸光度为0.20.8时，浓度测量的误差较小，准确度较高。 这可以通过选择不同厚度的吸收池和改变试样的用量及定容体积等方法进行调节。控制A在此范围内进行测定。 5 配对池的选择配对池的选择 吸收池由于在使用过程中受化学腐蚀或摩擦的程度不同，因此在相同条件下测定的本底吸光度有差异，差异最小的同一规格的吸收池称为配对池。 工作时用空气或蒸馏水在一定波长下测定吸光度值，选择配对池投入使用。第六节、紫外第六节、紫外可见吸收光谱法的定量分析实例可见吸收光谱法的定量分析实

14、例1.银杏内酯最大紫外吸收波长的测定 取银杏内酯标准品100mg，用定容至100mL（1mg/mL），从中取出0.20mL用石油醚定容至10 mL(20g/mL)。为减少测定随机性，分别用UV-3000（自动）、UV-754（手动）紫外扫描，得到银杏内酯紫外扫描曲线，结果见图。并确定最大吸收波长max=318nm。图 .银杏内酯紫外扫描曲线 2.2.银杏内酯标准曲线的制定银杏内酯标准曲线的制定 从标样备用液中抽取50L(5g/mL)、100L、150L 、200L、250L和300L分别用石油醚定容至10 mL，在max分别测定吸光度值，重复3次，绘制标准曲线。表. 标准曲线测定值（=318n

15、m） 标样取量5010015020025030010.1570.294 0.464 0.577 0.746 0.88120.1540.298 0.460 0.577 0.740 0.90430.1590.303 0.467 0.578 0.735 0.890平均值0.15670.2983 0.4637 0.5773 0.7403 0.8917 2.2.银杏内酯标准曲线的制定银杏内酯标准曲线的制定图.银杏内酯标准曲线(UV)y = 0.2917x + 0.0106R2 = 0.998500.20.40.60.8100.511.522.533.5藁本内酯浓度 (/100L/mL)紫外吸光度 A3、

16、重现性实验、重现性实验 从标样备用液中分别抽取100L用石油醚定容至17号10 mL容量瓶中，测定。结果见表3。由表可见，该法重现性较好，测量精密度较高。表.重现性实验编号1234567平均值标准偏差变异系数A318nm0.2980.2860.2940.3010.3090.2970.2940.2970.48%1.617%4、加样回收率实验、加样回收率实验 取一银杏叶样品，用石油醚转移并定容至100mL，从中分别取出0.5mL置于R0R5共6个25mL容量瓶中。从标样备用液中分别取出100、200、300、400、500mL置于上述R1R5共5个容量瓶中。将上述6（R0R5）容量瓶分别定容至25

17、mL测定。结果见下表。表. 加样回收实验平均回收率为97.66%，该法较可靠，测定结果准确度较高。样品号R0R1R2R3R4R5A318nm0.2170.3310.4590.5650.6630.845回收率(%)/97.6103.67599.11795.53792.385、稳定性研究、稳定性研究 从标样备用液中取出200L定容至10mL，分别于0、30、60、90、120min测max。测定间隙容量瓶密封冷藏保存。结果见下表。表. 2小时内银杏内酯A318nm的稳定性 2小时内银杏内酯A318nm基本不变，表明在石油醚溶液中2小时内基本稳定。 时间（min）0306090120A318nm0.5770.5850.5720.5690