肽核酸的研究进展及展望

1、肽核酸的研究进展及展望2004-11-04肽核酸的研究进展及展望刘娜何蕴韶中山大学达安基因诊断中心，广东广州510080摘要 肽核酸(PeptideNucleicAcids,PNAs), 是 20 世纪 90 年代 初发现的新型DNA/RNA同类物，是一类人工合成的用蛋白质骨架 代替核酸中的磷酸核糖骨架而形成的新型分子，由于它拥有诸多 DNA/RNA不具备的优点，因此具有非常广泛的分子生物学效应， 尤其在疾病的诊断和基因治疗方面有着广泛的应用前景。本文就 PNA寡聚体的结构、与核酸杂交的特点及杂交模式，分子生物学 效应，合成以及应用等方面予以综述。关键词肽核酸；反义；基因诊断自从1991年丹麦

2、Nielsen 设计并合成了肽核酸(PNA)以来，因 为其对核酸结合的高度特异性和高度亲和力而备受关注。成为继 寡核甘酸(oligodeolynucleotides,ODNs )以来更为有效而稳定 的反义，抗基因靶向性制剂。在基因诊断、基因治疗、端粒酶活 性的抑制等各个分子生物学领域都得到了广泛的应用，在基因调 节药物研究方面也显示了强大的潜力。1 PNA寡聚物的结构和分子生物学特性PNA是以电中性的肽链酰胺2-氨乙基甘氨酸组成的多聚酰胺键取 代了 DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架而形成的类似核甘酸的物质， 每个碱基通过亚甲城基接头(linker )与甘氨酸碳原子相连形成 与靶核酸杂交所需的序列1

3、 。 PNA的书写方式是从5'端至3' 端，像传统的DNA序列那样,PNA寡聚体的氨基末端(NH2)相当于 DNA的5'端,PNA寡聚体的埃基末端(COOH)相当于DNA的3'末 端。尽管PNA单体也具有一个游离的氮末端和一个游离的碳末端，但严格说来它既非肽又非酸，仅仅具有一个拟肽骨架，因而化学 上和蛋白质（肽）更为接近。它与DNA的相同之处在于PNA也携 带ATCG四种碱基单体，这就保证了 PNA能够按照碱基互补的原则 识别相应的碱基序列。与DNA不同的是它没有磷酸戊糖骨架，因 在结构上与 传统的寡核苷 酸 有所 不 同 ,故 其 与 寡 核 苷酸 相 比 ,

4、PNA寡聚体具有 独特的特性:PNA 寡聚 体 具 有较 好 的 热 稳定 性 、较 高 的结合亲合力及不依赖于盐浓度的特殊性。它们不被目前已知的任 何核酸酶或蛋白酶所降解2 , 3。PNA寡聚体的优越的特性还在 于它们形成三链体的能力及诱导双链核酸分子产生链置换的能力 4。而且，PNA与相应的DNA mRNA勺转录及翻译的启动位点结 合后，可以抑制相应的转录及翻译过程。这些特性使PNA在反义 药物的研究设计上有潜在的应用价值。2 PNA 与 核 酸 杂 交 的 特 点 及 杂 交 模 式2.1 PNA 与 核 酸 杂 交 特 点由于PNA的电中性骨架，具分子中不含磷酸基团，因此PNA链更 容

5、易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA链结合2。而且形成 的复合物分子较之DNA/DNA双链或DNA/RNA杂交链更为稳定1 ,3, 4 。有 报 道 证 实 4 ，在 同 样 的 杂 交 条 件 下 ，同 样 序 列 的 15mer 的 DNA/DNA双链的Tm值是53.3 C , DNA/RNA为50.6 C ,而相应的 PNA/DNA 的 Tm 值为 69.5 C , PNA/RNA 更高，为 72.3 C。即 PNA/DNA, PNA/RNA与同样 序歹U的DNA/DNA, DNA/RAN双链相比，每增 加一个 碱基数，Tm值增加1C。PNA与核酸杂交不仅具有很高的亲和性,还有很高的

6、特异性。PNA 对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低，一个15mer 的PNA/DNA分子在其中间段出现一个错配碱基，其Tm值下降8c 20 ， 两 个 碱 基 错 配 则 完 全 不 能 杂 交 4 ， 5 。PNA的一个独特性质是以平行或反平行的方式与核酸结合4。所 谓平行，就是PNA的氨基末端对着寡核甘酸5'端，反平行，就是 PNA的氨基末端对着寡核甘酸3'端。PNA与DNA（或RNA）形成的 双 螺旋 倾 向 于 反 平 行 结 合 4, 而 形 成 的 三 螺 旋 倾 向 于平行结合6 。且 两 种 结 合 方 式 都 得 到非 常 稳 定 的 复 合

7、 物 4 。当一个PNA分子侵入靶DNA序列时，一条DNA链被置换1.2,通过Watson-Crick 碱基配对原则迅速而高度特异的与其互补DNA结合 4。此后，第 二个PNA分 子又与PNA/DNA双 螺旋以Hoogsteen 键 形 成 非 常 稳 定 的 ( PNA) 2/DNA 三 链 结 构 ， 留 下 未 结 合 的 链 呈 单 链 状态。PNA的这些特性引起了反义和杂交技术领域众多研究者的 兴趣。2.2 PNA 与DNA RNA杂交模式如前所述，PNA单链可以通过碱基互补配对原则与相应的DNA RNA 单链形成稳定的双链结构4.7。同时，PNA多聚同源喀呢单链在 dsDNA 双

8、螺 旋 的 外 侧 以 Hoogsteen 键 的 方 式 与 互 补 碱 基 配 对 ， 形 成 PNA-dsDNA 三 链 体 。2.2.1 常规的PNA-dsDNA三链体模式 PNA多聚同源喀呢单链在 dsDNA 的 双 链 外 侧 ， 以 Hoogteen 键 的 方 式 与 互 补 的 碱 基 配 对 ， 形 成PNA-dsDNA三链体。当PNA富含胞喀呢时，这种结合较为稳定。2.2.2 三 链 侵 袭( Triplex invasion )模 式 这 种 方 式 形 成 的 复 合 物相当稳定，而且可以有效的抑制转录活性，从而在反义核苷酸 的研究上具有非常重要的意义。这种模式通常发

9、生在多聚同源嘧 噬PNA和相应的多聚喋吟dsDNA靶序列之间。Nielsen 等1在合 成PNA之初就观察到他所合成的连续10个胸腺喀呢PN A PNA-T10) 可以在DNAM螺旋内部,以Watson-Crick 方式替换原靶序列dsDNA 中的dT10,与靶序列的dA10相结合，形成PNA-DAN-PNA复合物的 结构；另一条dT10 PNA单链则在复合物外侧以Hoogsteen 键的方 式与复合物结合，从而形成稳定的四链体结构。预计该反应机理 是当“DNA呼吸”发生时，DNA双螺旋结构在瞬间变为单链结构， PNA利用它和DNA链的超强结合作用侵入到DNA双螺旋的内部， 以类似“拉链的方式

10、”完成侵袭反应1。这一利用DNA呼吸的原 理在随后的实验中被证实，当dsDNA存在负超螺旋结构而使双链 打开时，PNA结合效率明显提高8。而在转录过程中由于转录泡 的形成而导致双链暂时打开时，PNA也更容易侵入dsDNA双螺旋 内 部 9 。2.2.3 双 链 侵 袭 ( Duplex Invasion ) 模 式 这 种 结 合 方 式 常 发 生 在多聚同源喋吟PNA和dsDNA的同源喀噬靶序列之间,PNA侵入 到dsDNA双螺旋内部，以Watson-Crick 氢键的方式和靶序列结合， 形成DNA-PNA-DNA三体复合物。当PNA中的腺喋吟被二氨基喋吟代 替 时 ， 复 合 物 的 稳

11、 定 性 进 一 步 提 高 。 每 替 换 一 个 腺 嘌 呤 ， Tm 值 提高2c4c 10。这种结合方式至少在某些负超螺旋DNA靶序 列上是有效的。2.2.4 双 螺 旋 侵 袭 （ Double helix invasion ） 的 模 式 这 种 模 式 是在上种模式的基础发展而来的。在这种模式中，dsDNA两条链 上的某段序列同时作为靶片段，分别设计两条PNA探针，也称“假 互补PNA”（ Pseudocomplementary PNA,pc PNA ）。 探 针 中 的 腺喋吟（A）全部用二氨基喋吟（D）取代，胸腺喀呢（T）全部用琉 基尿嘧 啶 （sU） 取 代 。 这 样 一

12、 来 ， 当 两 条 含有 D、sU 的 pcPNA 与相应的dsDNA发生反应的时候，pcPNA可同时与dsDNA两条链中 相应的靶序列结合，形成稳定的PNA- dsDNA- PNA复合物。而 pcPNA本身两条链间由于D和sU立体结构的位阻作用却无法结合， 这 就保证了pcPNA 在识别靶序列的同时不会自 己互 补。 Lohse等11 的实验结 果 证 实这种结合特异而高效，估 计80以 上 的 靶序列是考 Watson-Crick 键的方式与PNA结合的。Demidov等12更 是对这种模式的动力学过程和可能的机制进行了详尽的探讨。与 以上几种链侵袭的模式比较，这种模式显然更具有广泛的应

13、用前 景。因为PNA不需要非得是多喀呢不可，它可以设计成任何与靶 序列互补的碱基序列。3 PNA 的 合 成PNA的合成目前采用固相肽核酸合成法合成PNA5。此法是使用 9- 氟烯 基甲氧碳酰（Fmoc） 肽合 成技 术 。 其中 单 体中 的 氨 基 主链 被Fmoc保护起来，这种方法使PNA结合于肽以及象生物素或荧光染 料 这样 的标记物上，每 一 合成 周期 大 约 需要 30 分钟 ，主 要 分为 以下几个步骤：装柱。与常规的将被合成的C末端氨基酸连接于固 相支持物的肽合成柱有所不同，PNA合成柱仅含有聚苯乙烯周相 支持物。洗涤。合成开始前，用二甲苯甲酰胺（DMF）洗涤PNA合 成 柱

14、 。 去 封 闭 。 以 六 氢 吡 啶 /DMF 去 除 Fmoc 保 护 基 团 。 洗 涤 ， 通过DMF洗涤去除过量试剂。活化和偶联。在存在二异丙基乙 胺和六氟代磷酸酯混合物的情况下，将新合成的PNA单体活化偶 联到固相树脂（或者偶联到延伸的PNA链上）。洗涤。用DMF洗 涤 去 除 过 剩 试 剂 。 加 帽 。通 过 溶 于 二 甲 基 吡 啶 /DMF 中 的 乙 酸 酐 将未反应基因加帽。洗涤。以DNF洗涤去除多余试剂。将PNA 产物与比例为4:1的三氟三酸及m-甲酚混合物共同温育以进行切 割和最终脱保护。这种切割和去保护的PNA寡聚体在260nm波长 下定量，通过反向液相色谱

15、和质谱进行纯度分析及PNA产物定量。 260nm下OD值 为1时,PNA产 物含量 相当于26仙g。4 PNA 应 用11.1 PNA 在 分 子 生 物 学 技 术 上 的 应 用PNA不带电荷，不会被核酸酶或蛋白酶降解，也不会与血清蛋白结 合，并且PNA与DNA或RNA连结能力强、特异性很高。PNA具有 普通寡核苷酸所没有的众多特性，在分子生物学技术方面应用广 泛。分析DNA中的点突变：PNA与DNA或RNA链结合形成的 PNA/DNA和PNA/RNA热稳定性高且对碱基错配敏感，一个碱基的 错配可使T m值大幅度下降，利用PNA此特点可以不用测序就能 分析DNA序列中的点突变。Czerny

16、 等13发明了一种PNA定向 PCR钳技术，它不需要测序，仅用简单的一步就能发现点突变的 存在。这种技术主要用来探测DNA片段中某种已知的点突变，在 C zerny设计的PCR反应体系中含有待扩增的模板DNA以及一个 PNA片段和两条DNA弓|物。其中，PNA与野生型DNA的5'端互补， DNA引物中一条与DNA突变型的5'端互补而另一条则是两者共有 的3'端引物。如果待扩增的DNA模板中没有发生点突变，则PNA 片段与DNA模板相连，PCR反应被终止；反之，则DNA引物与DNA 模板相连，PCR反应得以进行。通过改变相应DNA引物和PNA片 段 ,不 同 的 点 突

17、变 可 以 用 这 种 方 法 检 测 出 来 。 扩 增 较 长 序 列 的 DNA: PCR技术由于可以特异性扩增极微量的DNA片段，而在法医 学 、亲 子 鉴 定 和 分 子 生 物 学 研 究 中 得 到 广 泛 的 应 用 。但 是 , 被 扩 增 的DNA片段中可能含有多个不规则重复序列。这些含重复序列的 基因可以在退火时发生模板链内或链间杂交从而妨碍较长序列DNA的扩增。PNA的出现解决了这个问题。在PCR反应体系中，力口 入与DNA模板中间重复序列互补的PNA片段，该PNA片段与DNA模 板退火杂交，从而封闭已变性的DNA模板中的重复序列。PNA与DNA 模 板 退 火 杂 交

18、 温 度 一 般 较 高 (78), 在 此 温 度 下 , 模 板 中 间 的 重 复序列彼此不会杂交，当PNA封闭已变性的DNA模板中的重复序列 后，降低温度使PCR引物与变性的DNA模板两端杂交(温度一般为 60C ),然后升高温度(72 C )以完成PCR反应的延伸过程，与此同 时将PNA与模板分离。用此方法可以扩增出较长序列的DNA片段 14。特异性切割DNA:同源喀呢组成的PNA可以与含有一段同 源 嘌 呤 的 模 板 牢 固 结 合 , PNA 这 个 特 性 可 以 使 限 制 性 内 切 酶 只 对个别位点进行特异性切割。Veselkov 等15合成了一段由同源 喀呢组成的P

19、NA,然后用它去封闭DNA上一段同源喋吟组成的序 列。在未被封闭的DNA的其它部分甲基化后，再去掉PNA片段。因 为DNA模板中的同源喋吟部分受到了 PNA的保护，所以只有此段避 免 了 被 甲 基 化 ,因 此 也 只 有 此 段 能 被 限 制 性 内 切 酶 有 效 的 切 割 。 另 外，PNA可以用来从复杂的混合物中捕获特异性DNA和RNA片段， 并且在捕获的效率和特异性方面比使用DNA更好。B offa 等16 用生物素标记的PNA先与染色体中互补DNA片段结合，再与磁性亲 和素微球连接后将含CAG重复序列的转录基因从染色体中分离出 来。DNA杂交实验亦证实用该法提取的基因特异性高

20、，信息量完整。11.2 PNA 在疾 病 诊断领域的 应 用11.2.1 PNA用 于 荧光原位杂 交 （ FISH ） 分 析 这 是 目 前 为 止 发 展 较为成熟的一种技术，这项技术可以针对病原微生物的分子化石 rRNA的序列来设计PNA探针，利用该探针结合FISH的方法来分 离，鉴定，计数病原微生物。这项技术也可以利用卫星重复序列 来设计针对人类染色体的特异性PNA探针，用于染色体异常性疾 病的诊断。还可以设计出端粒酶PNA探针用于检测癌症及衰老问 题。11.2.2 PNA 用于“PCR夹”的研究 这是利用PNA与DNA的高亲和 力及高特异性，结合PCR技术检测目的核酸序列中的单碱基

21、突变。 由于PNA无法被Tag酶所识别，因此尚无法作为PCR引物。利用 这 一 特 性 ， 可 以 针 对 目 的 碱 基 设 计 出 一 对 单 个 碱 基 差 异 的 寡 聚 PNA 和DNA加入反应体系中，其中PNA仅能和野生型目的碱基配对， DNA引物则与突变型目的碱基配对。当模板是野生型时，PNA利用 它与DNA的高度亲和力竞争性彻底抑制了 PCR反应的进行，使反 应无任何产物生成。而当模板是突变型时，DNA引物即可以结合 到模板上，经过足够多的循环数，扩增出目的条带。该技术已经 被 广 泛 应 用 于 各 种 基 因 点 突 变 的 检 测 17 。11.3 基 因 组 切 割 和

22、 图 谱 分 析喀呢同聚体PNA与dsDNA结合形成的D-环结构为单股DNA,它对 S1酶和绿豆核酸酶敏感1,因此可以用S1酶对基因组DNA进行 定点切割和基因克隆。但这样切割的DNA有片段缺失。采用PNA 对，即一分子PNA与基因的模板链结合，另一分子PNA与非模板 链结合，如此形成的P-环能限制S1酶的切割范围1.18 。S1酶 定点切割dsDNA虽然简单、有效，且不需要甲基化的步骤，但它 不能产生粘性末端，也不能进行基因组DNA酶切图谱的分析。PNA与dsDNA结合后，可以保护重叠区内或距结合区23个核甘 酸以远的核酸限制性内切酶位点不被甲基化酶所甲基化，也不被 限制酶所切割19。PNA

23、与染色体或大片段DNA结合后，用甲基 化酶处理，PNA结合区以外的甲基化酶识别位点被甲基化，不会 被匹配限制酶所切割。当PNA从dsDNA链上洗脱下来后，PNA结 合区内的限制酶位点因未被甲基化而可被特异的限制酶切开，从 而达到对染色体和大基因组片段进行定点切割的目的。11.4 基 因 表 达 调 控从基因到蛋白质要经过转录形成mRNA再以mRNA为模板译成蛋白 质的过程。PNA通过与dsDNA或RNA结合而影响转录和翻译的过 程。用T3、T7及哺乳动物细胞pol II所做的实验表明20.21, PNA与dsDNA中的模板链结合能抑制转录的延伸。这种抑制效率 与PNA组成有关，一般1015聚体

24、PNA即可有效抑制。T10同聚 PNA导致的转录在PNA的第一位碱基，T5C1T4PNA在第2或第3位 碱基上。T2C1T2C1T4PNA则在最后的3位碱基上。PNA抑制转录延 伸的作用比寡核苷酸强，且不需要进行修饰。实验证明同聚嘧啶 PNA与dsDNA进行结合形成的P-环可以作为转录的启动子，与DNA 自身启动子竞争转录系统22。启动反义RNA链的合成，这是很 有意思的结果。如果PNA将来能作为基因打靶的药物，它可从反 基 因 ( antigene ) 和 反 义 mRNA( antisense ) 两 个 环 节 阻 断 基 因 表达。PNA与RNA结合能阻断逆转录合成cDNA,与寡核甘酸

25、不同,这种阻 断 是 直 接 的 。 在 转 染 了 SV40 大 T 抗 原 的 细 胞 内 注 射 PNA， 发 现 大 T抗原的表达从PNA靶序列处剪短，而对B -半乳糖甘酶蛋白则能 完整表达，说明这种阻断作用是特异的，与用细胞浆提取物所做 的实验结果一致，说明PNA在细胞内至少能从RNA水平上发挥基 因靶向药物的作用20, 一般15聚体PNA即可。11.5 PNA 在 基 因 治 疗 上 的 应 用 基因治疗是指制备正常基因代替遗传缺陷基因或关闭、抑制异常基因。基 因 原位 修 复 是 最 理想 途 径 , 但 目 前在 技 术 上 很难做 到 。由于肽核酸 具 有广 泛 生 物 学

26、效应 ,作 为 基 因 治疗 药 物 有 很大潜 能 。11.5.1 PNA 作为反义药物 PNA的反义性质是指PNA与mRNA吉合, 从 而 阻 断 翻 译 , 使 蛋 白 质 的 合 成 不 能 进 行 。 理 论 上 ,PNA 是 最 有 前 途的反义药物。PNA不受血清及体液中的核酸酶及蛋白酶降解， 是作为反义药物的重要前提。P NA与RNA的结合力强，特异 性高，因而抑制特定基因表达所需的剂量很小。PNA与单链RNA 结合，同时也与其相应单链DNA结合，而且PNA/RNA复合物的稳定 性远较PNA/DNA的稳定性为高。PNA可特异地阻遏翻译过程，形 成双螺旋的PNA如果与起始密码子区

27、域互补，可阻遏翻译，并表现 出剂量依赖型；如果与编码区互补则无阻遏作用；而形成三螺旋 的PNA在两种区域均可阻遏翻译23。11.5.2 PNA反基因药物 反基因策略的作用靶是DNA,通过在每个基 因组中形成PNA/DNA复合物，理论上就可抑制转录。当作用靶是 mRNA寸,PNA必须与细胞中大量m RNA结合才可抑制翻译，所以反 基因策略更有吸引力。PNA能与双链DNA结合形成很稳定的链取 代 复 合 物 ,因 此 它 们 是 很 好 的 反 基 因 试 剂 。 已 有 实 验 证 实 这 种 PNA2/ds DNA复合物在体外能阻断原核及真核RNA聚合酶的延伸 24。其中的一个实验研究了 PN

28、A对噬菌体RNA聚合酶T 3及T 7 参与的转录的影响，靶序列位于bluescript K S +质粒上T 3或 T 7启动子的下游。实验发现，结合于模板链针对高喋吟位点的10 聚PNA可阻止转录，而非结合于模板链的PNA则不能阻止转录。Nielsen 等25进行引物延伸实验发现在PNA结合的位点,Tag DNA 聚合酶和Ecoli DNA聚合酶大片段受到抑制。同样PNA可抑制RNA 聚合酶，终止基因的转录。另外,PNA除了阻止RNA RNA聚合酶外， 针对DNA结合蛋白识别基因控制区的PNA也可能下调基因复制和 转录。5 PNA 展 望根据PNA的代谢稳定性，主要将其用于抑制基因表达的反义药

29、物研 究 领 域 ， 国 外 几 家 制 药 及 生 物 技 术 公 司 ， ISIS 、 PE 等 公 司 均 投入大量精力从事开发研究；根据其与DNA优良的杂交稳定性，PNA又被广泛用于DNA分子识别和操纵。PNA可以广泛用于病原体、 遗传病检测的分子杂交、原位杂交、突变分析、抗癌、抗病毒反 义核酸研究和应用。尤其是PNA可以取代寡核甘酸用于基因芯片 的制备，将比普通基因芯片更稳定，特异性也更好，被认为是基 因芯片的升级产品，相信在临床诊断芯片的开发方面。PNA也可 用于定量PCR,可以用于实时检测PCR的扩增反应；也可将其做 成PNA Beacon ,用于实时监测细胞内的RNA表达。随着

30、PNA基础 研究的不断深入和新技术的不断出现，PNA将显示出无比优越的 性能和更为广阔的应用前景。参考文献1 Nielsen PE et al. Science, 1991; 254:1497.2 Peffer NJ et al . Proc Natl Acad Sci USA ,1993;90(22):10648.3 Ecker DJ et al . Natl Biotechonl,1998;16:332.4 Egholm M et al. Nature, 1993; 365: 566.5 ScarfiS,GA et al.BiochemBio-physResCommun,1997；236(2):323-326.6 NielsenPE,EgholmM,BuchardtO.Bioconjug