己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

1、己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备陈德坤1,郑增忍2,曲志娜2,雷莉辉1,张佩君3 （11西北农林科技大学动物科 技学院，陕西杨凌712100;21农业部动物检疫所，山东青岛266032;31陕西省教育学院生物系，陕西西安 710003摘要:以己烯雌酚（D ES、琥珀酸酊和牛血清白蛋白（BSA等为主要原料，采用混 合酸酊反应，首先合成己烯雌酚半琥珀酸酯（D ES 2H S，经质谱分析鉴定后，再将D ES 2H S结合到BSA上，并用SD S 2PA GE对D ES 2H S 2BSA进行测定。以D ES 2H S 2BSA免疫家兔6次，用琼脂双扩散试验测定抗体。试验结果表明，高分辨质谱 测得合

2、成的D ES 2H S分子量为368;BSA 2H S 2D ES的SD S 2PA GE图谱经相关 软件分析表明，单个BSA上结合有32个D ES 2H S ;琼脂扩散试验结果证实，免疫兔 血清中含有抗D ES的抗体。本试验为下一步研制 D ES残留免疫检测试剂盒及抗 D ES单抗奠定了基础。关键词：己烯雌酚;琥珀酸酊;牛血清白蛋白；混合酸酊反应；抗 D ES抗体中图分类号：S 852143文献标识码:A文章编号:100524545（20040420364203己烯雌酚（D ES是一种人工合成的雌激素，在医学临床上普遍用于妇科病的治疗，而且还被用作动物饲料添加剂，以促进动物生长，提 高产量1

3、,2。国内外大量研究表明3,己烯雌酚可以破坏机体遗传物质，导致基因突 变而引发机体月中瘤。因此，国内外所颁布的食品安全法均规定，动物性产品及食品中 不得检出己烯雌酚。目前，国外已经建立了成熟的己烯雌酚残留免疫检测方法，并有相关的诊断试剂盒。目前，国内检测己烯雌酚主要采用高效液相色谱（H PL C法或气 相色谱2质谱（GC 2M S法。为开发研制具有我国自主知识产权的药物残留 （包括己 烯雌酚免疫检测试剂盒，达到能够对批量样品进行快速、准确检测的目的，特进行了 本研究。1材料与方法111主要试剂和仪器己烯雌酚，纯度99%,美国Sigm a公司产品；琥珀酸酊，上海化学试剂公司；氯甲酸异丁酯，CP，

4、上海飞详化工厂；三正丁胺,CP北京化工厂进口分装；牛血清白蛋白（BSA，华美生 物工程公司；其他试剂均为A R级。Z AB 2H S 仪器、FT 2M S A PXX 仪器、凝胶成像系统（UV P B i o i m aging System 及其分析软件（lab w o rk s 410I m ageA c 2qu isiti on and A nalysis Softw are。112试验动物 成年健康家兔，体质量215kg左右,购自青岛医学院试验动物中心。113己烯雌酚半琥珀酸酯（D ES -HS的合成 D ES 2H S的合成路线如下：HOCC 2H 6C C 2H 6OH +O C

5、OCH 2COC H 2HOC 2H 6c C 2H 6OC OCH 2CH 2C OOH收稿日期：2003212222作者简介：陈德坤（19642男,副教授，博士。将70m g D ES溶于5mL 口比呢中，搅拌至完全溶解，再加入琥珀酸酊25m g , 置于通风橱中，在室温下搅拌48h。反应完成后，将反应液移入30mL冰蒸储水与 5mL浓盐酸组成的混合液中静置过夜，抽滤析出的沉淀，并以蒸储水洗至pH 515左右，真空干燥，得粗产品。将所得粗产品加入丙酮溶解后抨入等量的硅胶，室温下晾干，用200300目硅胶柱层析分离 用TL C监测, 收集R f =0109（展开剂，石油醴：丙酮=3 ： 1的

6、点合并，常温下干燥，即得D ES 2H S纯品。对该物质进行高分辨质谱测定。114 D ES -HS -BSA的合成 将D ES 2H S 2BSA 50m g溶于二氧六环中，置 4c下10m in，然后加入20AL三正丁胺,混匀,再加入15AL氯甲酸异丁酯4c条件下 搅拌30m in，此为甲液。另取150m g BSA溶于20mL的70%二氧六环水溶液中，此 为乙液。将甲液与乙液合并4c下搅过夜，将反应液流水透析2h，然后换成平衡盐 溶液继续透析48h。浓缩透析液，冷冻干燥。用5%的积层胶和10%的分离胶对D ES 2H S 2BSA进行SD S 2PA GE鉴定，通过紫外凝胶成像系统分析软

7、件分析得出D ES 2H S 2BSA的分子量，以此为依据推算单个 BSA上结合D ES 2H S的数目。115 D ES -HS -OVA （卵清蛋白的合成 参照方法114进行。116动物免疫 试验 用无菌生理盐水溶解D ES 2H S 2BSA后,与等量的弗氏完全佐剂混合，在混 合振荡器上充分振荡，使其完全乳化,D ES 2H S 2BSA的最终含量为1g L。在家兔 脊椎两侧交叉选取68个点，做皮下注射免疫，免疫剂量为2mL只。2025d进行第2次免疫，免疫途径及免疫剂量同第1次，佐剂为弗氏不完全 佐剂。以后，每隔15d加强免疫1次,免疫剂量均为上次的2倍,免疫途径为皮下注射 免疫时不使

8、用弗氏佐剂。免疫共进行 6次，最后1次免疫后10d经心脏无菌采血，分 离免疫血清。117抗D ES抗体的测定 按照常规的琼脂双扩散试验进行。在 1%琼脂糖凝 胶上打出梅花孔，挑去孔中琼脂块，用015%融化琼脂封底。向中央孔加入分离的免 疫兔血清,周围孔分别加 D ES 2H S 2BSA、OVA、D ES 2H S 2OVA，在37c感作 2448h后，将琼脂糖凝胶用生理盐水漂洗 24h ,用011%考马斯亮蓝染液染色，经脱色 后，对琼扩试验结果照相。2结果HRM S表明，新o2.1 D ES -HS的高分辨质谱测定结果FAB M S测定结果为,M +368(63(M +N a +391(17

9、,351(M 2OH (16,307(M 2OH 2CO 2(6(图 1。 分析,C 22H 24O 5+N H 4计算值为38611962实测值为38611959误差017Ppm，在10Ppm范围内。结果 合成的D ES 2H S的分子量为386图1 D ES 2H S的质谱测定结果2.2 D ES -HS -BSA 的 S D S -PAGE 结果 为进一步证实 BSA分子上确实挂载了 D ES半抗原，并计算出每个BSA分子上所结合的半抗原数目，对D ES 2H S 2BSA进行了 SD S 2PA GE （图2。电泳图 谱显示出BSA的泳动速度大于 D ES 2H S 2BSA，说明D

10、ES 2H S 2BSA的分子量大 于BSA，证明D ES 2H S已经结合在BSA上。通过紫外凝胶成像系统分析软件分 析得出,D ES 2H S 2BSA的相对分子质量为77950,BSA的相对分子质量为 66200，每 个BSA分子上结合的半抗原数目为（77950-66200+ 368= 32图 2 D ES 2H S 2BSA 的 SD S 2PA GE 结果 11M arker ;21BSA 标准品;31D ES 2H S 2BSA2.3 抗D ES -HS抗体的测定结果 以D ES 2H S 2BSA免疫家兔，家兔不仅产生针对D ES 2H S的抗体，还产生针对BSA表面功能抗原决定

11、簇 的抗体，这是琼扩试验中免疫血清孔和 D ES 2H S 2BSA孔之间形成的沉淀线比较粗 的原因（图3。由于BSA和OVA无共同的抗原性4,因此OVA孔和中央孔之间无 沉淀线形成。D ES 2H S 2OVA孔和中央孔之间形成1条细而清晰的沉淀线，并且该 沉淀线与免疫血清孔和 D ES 2H S 2BSA孔之间形成的沉淀线完全融合，说明免疫血 清中确实含有抗D ES 2H S的抗体O图3抗D ES抗体的琼扩试验结果中央孔1免疫血清；1,3孔.D ES 2H S 2BSA ;4,5孑L.D ES 2H S 2OVA ;2,6 孔.OVA3讨论小分子药物残留是影响动物性食品安全的关键因素之一。

12、对这类小分子残留的常规检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法等。这类方法灵敏度高、准确，但比较耗时，且需要的仪器昂贵，难以进行大批量样品的检测。为满足实践中批量样品残留检测的需 要，近年来相继研制出了多种用于小分子药物残留检测的免疫试剂盒，如盐酸克伦特 罗、氯霉素等免疫检测试剂盒。国内尚未见己烯雌酚残留免疫检测试剂盒研制的报 道。本研究制备出的抗己烯雌酚抗体，为下一步研制己烯雌酚残留免疫检测试剂盒 奠定了基础。半抗原本身无免疫原性，只有当其与载体结合后，才能够获得免疫原性。对于没 有氨基或竣基基团的半抗原，必须进行适当的化学修饰，在其上加载1个含有氨基或 竣基的基团，才可以将其连接到载体上。己烯

13、雌酚便属于此类半抗原。对己烯雌酚 进行化学修饰应当尽可能不影响己烯雌酚的结构和构型，否则免疫动物制备出的抗 体可能与己烯雌酚本身的亲和力较差，或与其他物质发生交叉反应的几率较高。考 虑到己烯雌酚本身属于小分子，所以在加载功能性竣基基团时，我们使用的是丁二酸酊，只与己烯雌酚一侧的酚羟基反应，形成己烯雌酚半琥珀酸。这样，不仅最大限度地 减少了对己烯雌酚本身结构和构型的影响，而且形成的己烯雌酚半琥珀酸有一个较 长的臂”号载体结合后有利于淋巴细胞的免疫识别。据报道 5,当1个载体结合 2535个半抗原分子时，免疫动物相对容易产生抗体。本试验以含有32个D ES的BSA 2H S 2D ES免疫家兔，用

14、琼脂双扩散试验进行的特异性抗体检测也证实了这一 点。Rom bau ts等6报道,D ES也能够与 X2乙基澳化丁酸盐反应，产物为D ES 2X2乙基澳化丁酸。他们通过 X2乙基澳 化丁酸盐与己烯雌酚一侧的酚羟基发生化学反应，在己烯雌酚上加上一个臂”长为4 个碳原子的带有竣基的基团，从而使经过化学修饰的己烯雌酚能够与载体结合。但 是他们制备的经过化学修饰的己烯雌酚极不稳定，且难以提纯。本试验制备的 D ES 2H S稳定性较强，也能够提纯，这不仅有利于对D ES 2H S进行分析鉴定，同时对于下 一步将D ES 2H S顺利地结合到BSA上十分重要。本研究制备抗己烯雌酚抗体，不仅为建立己烯雌酚

15、残留的免疫学检测方法打下 了良好基础，也为进一步研制抗己烯雌酚单抗提供了很好的手段。(本研究在进行己烯雌酚化学修饰的工作中，得到兰州大学化学系田暄教授的大力协助，并承蒙田暄教授对质谱结果进行分析判定，在此表示衷 心感谢参考文献：1冯红旗，李洪玲，杨如镜，等.12例T urner综合征内分泌激素的观察J .中国优生与遗传杂志，1999,7(2:54255.2杨胜林，蒋诚绩.己烯雌酚对山羊育肥增重效果的研究J .当代畜牧,2001,(2:31232.3 N ielsem M ,B j rnsd ttir S ,H yer P E ,et al .O ntogeny of oestro 2gen r

16、ecep to r a in gonads and sex ducts of fetal and new bo rn m ice J .J R ep rod Fertil ,2000,118:1952204.4 Dong M in ,L I Guofu ,L i J in ,et al .I mm uno logical detecti on of ar 2butin J .T singhua Sci T echno l ,1999,4(3:3112316.5姜 玲,章文才，柯 云，等.抗能皮素抗体的研制J .免疫学杂志,2000,16(5:3832386.6 Rom bauts P ,P i

17、erdet A ,Jouquey A .Study on the antiserum ofD iethylstilbestro l J .R A cad Sci Ser D ,1973,277:192121924.Syn thesis of D iethylstilbestrol and the Prepara tion of Its An tibodyCH EN D e 2kun 1,ZH EN G Zeng 2ren 2,QU Zh i 2na 2,L E IL i 2hu i 1,ZHAN G Pei 2jun 3(1.Colleg e ofA n i m a l H usband ry

18、 and V eterina ry S cience ,N orthw estern S ci 2T ech U n iversity of A g ricu ltu re and F orest ,Y ang ling ,S haanx i 712100,Ch ina ;2.Q ua ran tine Institu te of A g ricu ltu ra l M in istry ,Q ing d ao 266032,Ch ina ;3.B iology D ep a rt m en t of S haanx i E d uca tiona l Institu te ,X i'

19、 an 710(inaAbstract :D iethylstilbestro l hem isuccinate (D ES 2H S w ere syn thesized andcoup led to bovine serum album in (BSA w ithm ixed 2anhydride m ethod ,and the pu rified D ES 2H S w ere iden tified by h igh m ass spectra (HRM S ,and the BSA 2H S 2D ES w ereiden tified by SD S 2PA GE .BSA 2H

20、 S 2D ES w ere in jected to b ig ear rabb its 6ti m es in certain in terval.A n tibody to diethylstilbestro l w ere determ ined by agar diffu si on test .T he resu lts show ed that the mo lecu lar w eigh t of syn thesized D ES 2H S in 36811959,and the num ber of D ES 2H S coup led to each BSA mo lec

21、u le is 32.T he an tibody to diethylstilbestro l does ex ist in the i m m un ized rab 2b it serum .It w as demon strated that artificial i m m unogen of diethylstilbestro l cou ld be syn thesized by m ixed 2anhydride m ethod and the specificity of the po lyclonal an ti 2diethylstilbestro l an tibodi

22、es cou ld be p roduced .Key words :diethylstilbestro l ;succin ic anhydride ;bovine serum album in (BSA ;m ixed 2anhydride m ethod ;an ti 2diethyl 2stilbestro l an tibodies半胱胺对成年鹅血浆中几种激素及胆固醇水平的影响艾晓杰1,郑元林2,刘根桃2,陈伟华2,韩正康2 (11上海交通大学农业与生物 学院动物科学系，上海201101;21南京农业大学农业部动物生理生化重点实验室，江苏南京210095摘要:以14只装有超静脉瘦管的成年杂交鹅(川白衣湖，圈养，自身对照。试验 期于日粮中一次性添喂半胱胺(按每千克体质量100m g经瘦管采取对照期和处理 后第1、3、5、7天的血样，用R I A双抗法和分光光度法分别测定激素和胆固醇的 含量。试验期各大，生长抑素的含量较对照期的(1189±0110Ag吩别显著降低(P <0101 或 P <010541118% 261