Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的构建及其IDO1活性和表达的研究

1、    hepa1-6原位肝癌小鼠模型的构建及其ido1活性和表达的研究    郭磊磊杨青【摘 要】目的：建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型，并研究该模型中吲哚胺2，3-双加氧酶1 （indoleamine 2，3-dioxygenase 1， ido1）的活性和表达，为研究ido1在肝癌中的作用及ido1抑制剂的药效奠定基础。方法：培养收集hepa1-6小鼠肝癌细胞并调整浓度至2×106/50 l，将其注射于小鼠肝左叶中，术后14天处死小鼠，收集血清，解剖并观察小鼠肝脏肿瘤的形成情况，对肿瘤组织进行he染色，qpcr法和western blo

2、t法分别检测肿瘤中ido1 mrna和蛋白的表达水平，hplc法检测血清中色氨酸和犬尿氨酸的含量。结果：小鼠肝上形成肿瘤且呈弥漫性生长并发生肝叶间的转移;肝癌小鼠血清中ido1活性、肿瘤中ido1 mrna和蛋白水平的表达比野生型小鼠的均高。结论：成功建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型，该模型可用于ido1功能及ido1抑制剂药效学研究。【关键词】原位肝癌;吲哚胺2，3-双加氧酶1（ido1）;ido1抑制剂r730.3a1672-3783（2020）06-18-01肝癌是世界范围内的恶性肿瘤，预后差，现有的治疗效果不尽人意。免疫疗法是肝癌治疗的新希望，免疫检查点阻断疗法在肝癌中已有应用1。吲

3、哚胺2，3双加氧酶1（indoleamine-2，3-dioxygenase 1，ido1）是犬尿氨酸代谢通路中的关键限速酶，催化人体必需氨基酸色氨酸（tryptophan，trp）分解代谢生成l-犬尿氨酸（kynurenine，kyn）。它在多种肿瘤里高表达，使肿瘤组织中cd8+ t细胞功能和增殖減弱，foxp3+ treg细胞增殖，促进肿瘤细胞生存及肿瘤免疫逃逸等2。ido1被认为是潜在的免疫检查点，ido1抑制剂是肿瘤免疫治疗的新型候选药物3。目前尚无ido1抑制剂药物上市，但多个ido1抑制剂如indoximod、epacadostat、bms986205等已经进入临床试验，其中包括b

4、ms986205与pd-1抗体联合治疗肝癌的一项i期/ii期临床实验（nct03695250）4。本研究在建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型的基础上，研究了该模型血清中ido1活性和肝肿瘤中ido1 mrna与蛋白水平的表达，为研究ido1在肝癌中的作用及ido1抑制剂的药效学奠定基础。1 实验材料与方法1.1 主要实验材料c57bl/6小鼠（上海杰思捷实验动物有限公司）、hepa1-6小鼠肝癌细胞（）、he染色试剂盒（华安生物）、逆转录及qpcr试剂盒（诺唯赞）、ido1抗体（华安生物）等。1.2 试验方法培养收集hepa1-6细胞并用pbs调整浓度至2×106/50 l。脱毛膏褪

5、去小鼠胸腔和腹部的毛并腹腔注射160 l 5%水合氯醛使小鼠麻醉;沿小鼠剑突剪开1cm的开口，使肝左叶暴露并注入50 l细胞悬液（含2×106个细胞），棉球按压止血30 s，器官归位并缝合创口。术后1-3 h小鼠苏醒，正常饲养。术后14天，小鼠引颈处死，收集血清，解剖并观察肝肿瘤发生和发展情况，收集小鼠肝肿瘤组织。hplc检测血清中kyn和trp含量，肿瘤组织进行he染色，提取肿瘤组织总rna和蛋白，用qpcr法和western blot法检测ido1 mrna和蛋白表达。具体实验步骤参照文献18。1.3 统计学分析采用grapsd prism 5.0进行数据处理和图像绘制，所有实验

6、数据均以平均数±标准误（±se）表示，两组数据间比较采用独立样本t检验，以p<0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 造模情况术后14天小鼠腹部伤口全部愈合，手术缝合线全部自动脱落。人道主义处死小鼠，解剖并取出肝脏组织，进行观察，如图1所示，棕色部分为肝组织，白色部分为肿瘤组织，肿瘤在肝上大面积弥散性生长，并且已经发生肝叶间的肿瘤转移，小鼠接瘤14天后存活率和成瘤率均为100%。2.2 组织病理检查肝肿瘤组织he染色结果如图2所示，深紫色部分为肿瘤区（黄色圈区域），其细胞排列无规则，细胞核大，染色较深;浅紫色偏红区域为正常肝区，细胞排列整齐，细胞核染色较浅。此外

7、有小片独立的肿瘤区出现（黑色箭头指处），表明肝癌细胞已在肝内发生转移，印证了上述解剖观察结果。2.3 肝肿瘤组织中ido1 mrna和蛋白表达水平的检测qpcr法检测肝肿瘤组织中ido1 mrna的表达，western blot法检测ido1蛋白的表达，以野生型（wt）小鼠正常肝组织为对照，结果如图3所示hepa1-6原位肝癌小鼠肝肿瘤组织中表达的ido1 mrna和蛋白均比wt小鼠的高。2.4 小鼠血清中ido1活性的检测hplc法检测野生型小鼠（wt）和hepa1-6原位肝癌小鼠血清中trp和kyn的浓度，以（trp/kyn）*100的比值来定量表示小鼠血清中的ido1活性。结果如图4所示

8、，hepa1-6原位肝癌小鼠血清中kyn浓度水平较wt小鼠的高，trp浓度水平与wt的基本一致，（kyn/trp）*100的值变化与kyn浓度水平变化一致，即hepa1-6原位肝癌小鼠血清中的ido1活性高于wt小鼠血清中的。3 讨论hepa1-6原位肝癌小鼠血清中ido1活性是野生型小鼠的2.5倍，本底ido1活性较高，能较好的反映在给予ido1抑制剂后小鼠血清中ido1活性的变化情况。同时，hepa1-6原位肝癌小鼠血清中ido1活性和肿瘤中ido1的表达均高，是研究ido1与肝癌关系的良好工具。总之，本研究在建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型的同时，研究了该模型血清中ido1活性和肝肿瘤中ido1 mrna和蛋白水平ido1的表达，发现肝癌小鼠血清中ido1活性、肝肿瘤中ido1 mrna和蛋白水平的表达均较野生型小鼠中的高，为研究ido1在肝癌中的作用及ido1抑制剂的药效学奠定基础。参考文献】周晨，刘家成，石钦，等. 肝癌分子靶向药物及免疫抑制剂治疗的研究现状及进展j. 中华介入放射学电子杂志，2019，7（3）：243-250.毛耀南，于萍，任敬慧，等. ido小分子抑制剂的研究进展j.实用药物与临床，