醋酸乙酯萃取绿原酸过程研究

1、醋酸乙酯萃取绿原酸过程研究作者：杨海燕，孙海峰，汪爱国，陈福明，郭志刚【关键词】萃取;，绿原酸;，纯化摘要：对金银花粗提粉中萃取高纯度绿原酸的方法进行了研究。萃取分配系 数d测定结果表明，醋酸乙酯是纯化绿原酸的适用溶剂。四级萃取的绿原酸回收 率将近90%,得到的产品经uv和hplc检测绿原酸含量分别为69. 1%和35. 2%。 从lc-ms检测结果推断，产品中含有绿原酸异构体和异绿原酸。关键词：萃取；绿原酸；纯化study of extracting process of chlorogenic acid by ethyl acetateabstract: the extraction me

2、thod of chlorogenic acid (cga) f rom the crude honeysuckle powder is studied the distribution coefficient d indicated: ethyl acetate was the most suitable extractant f or cga's pur ificat ion. after 4-stage extractions, test date showed that cga's content of the product were 35. 2% and 69. 1

3、% by hplc and uv respectively. the experimental cga recovery ratio was almost 90%. the product was determined containing cga's isomer and isochlorogenic acid by lcms testkey words: extraction; chlorogenic acid; purification绿原酸(chlorogenic acid )是由咖啡酸(caffeic acid )与奎尼酸(鸡纳 酸，quinic acid,即1轻基六氢没食子

4、酸)组成的缩酚酸，异名咖啡软酸，化学 名30咖啡酰奎尼酸(30caffeoylquinic acid ),分子量：354.30,是植物体在有 氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，为众多药材(如金银花、 茵陈、杜仲)以及中成药(如复肝宁、双花注射液)抗菌解毒、消炎利胆的主要 有效成分，同时是某些中药制剂质量控制的重要指标1。随着中药现代化进程 的加快，制药厂家对金银花等的提取物要求越来越高，特别是欧、美国家制药企 业要求中药提取物中的单体成份越纯越好，以便定性定量分析、使用。目前，我 国以金银花为原料加工制成的市售产品除复方制剂外，多为浸膏或粗粉2,其 中绿原酸含量较低，高含量的绿

5、原酸产品上市量很少，且价格昂贵，远远不能满 足市场需求。研究新的高含量绿原酸提取分离方法，降低提取分离成本是当务之 急。目前从金银花中提取高纯度绿原酸的研究方法主要有溶剂萃取法和大孔树脂 吸附法。前者容易实现工业化生产，可选择的溶剂包括醋酸乙酯、正丁醇、异戊 醇，后者在进行规模化生产时存在生产周期长的缺点，故而本文以市售金银花粗 粉为原料，选择沸点低、价格低的醋酸乙酯为溶剂对绿原酸进行萃取纯化，探讨 萃取过程的影响因素，为下一步工业化生产高纯度绿原酸奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器采用水提制备的金银花粗提粉，购于安徽宣城百草植物工贸 有限公司。绿原酸对照品购自美国sigma公司。醋酸乙酯

6、等均为分析纯。美国 agilent公司1100型高效液相色谱。美国agilent公司8453型分光光度计。 agilent 1100型高效液相色谱-esquire 2000型离子阱质谱检测仪。质谱扫描条 件：离子化源为电喷雾离子化源esi,检测方式为二级质谱，全范围为50 2 200 m/z,加热毛细管温度为300°co1.2工艺流程金银花粗提粉-水溶一醇沉一蒸去乙醇一醋酸乙酯萃取 t减压浓缩-冷冻干燥金银花粗提粉水溶液的醇沉过程本文作者已进行了详细 研究，确定最佳醇沉度为60%,醇沉可有效去除金银花粗粉中的杂质，有关研究另 文陈述。醇沉后离心过滤，回收乙醇，剩余液用盐酸调节ph后进

7、行萃取。1. 3绿原酸含量测定1. 3. 1 uv法准确称取绿原酸标品10 mg,用50%甲醇定容至100 ml,分别用 50%甲醇稀释10, 5, 3. 33, 2. 5, 2, 167倍，以50%甲醇为空白，用1 cm比色 杯于327 nm波长处测吸收度。以吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘 制绿原酸标准工作曲线，得到回归方程：y= 18. 302x, r=0. 999 5。绿原酸含量 在10.0-60.0 nig/ml,范围内，浓度与吸光度间呈良好的线性关系。1. 3.2 hplc法含量测定色谱条件：参照2005年版中国药典附录中绿原 酸的高效液相色谱法3。色谱柱：zorbax

8、c18 ods （ 250 mm x 4. 6 mm, 5 pm）; 流动相：乙m-0. 4%磷酸溶液（13 : 87）;检测波长为327 nm;柱温：25°c;进样 量：20 m l 线性回归方程：y= 4& 64x-52. 57, r=0. 999 1 o 绿原酸在 26. 0- 173.3 mg/ml与峰面积呈良好的线性关系。14总糖含量测定采用蔥酮硫酸法4 。线性回归方程：y= 196. 96 x, r=0. 998 9。总糖在5.0-100.0 mg/ml范围内，浓度与吸光度间呈良好的线性关系。2结果与分析2.1原料含量分析将金银花粗提粉制成供试液，其中总糖含量为4

9、3.33%,总 绿原酸含量为12. 0%,绿原酸含量为5. 5% （ hplc测定）。2.2金银花粗提粉在醋酸乙酯水体系中的d值测定预先配制醋酸乙酯与去 离子水体积比为1 ： 1混溶分相后的上、下相。随后称取10 g粗粉，溶于100 ml 配制好的下相中，用浓盐酸调节ph=2. 0,量取50 ml该溶液，加入到100 ml分 液漏斗中，加入等体积预先混溶过的醋酸乙酯，充分振摇20 min,达到平衡后， 分出上、下相，分别取1 ml用甲醇稀释测定浓度。测得在醋酸乙酯-水体系中的 萃取分配系数0=0.69.参考绿原酸在其它溶剂体系5的d值（见表1）可以 看出，绿原酸在醋酸乙酯里的分配比较大，醋酸乙

10、酯较正丁醇而言，沸点低，便 于回收溶剂，且价格低廉。表1绿原酸在不同溶剂体系的d值（略）2. 3 ph对萃取结果的影响分别称10 g金银花粗提粉配成50 ml水溶液，用 一定浓度的盐酸溶液分别调ph值为1.0, 2.0, 7.0,用醋酸乙酯按相比1分别称 10 g金银花粗提粉配成50 ml水溶液，用一定浓度的盐酸溶液分别调ph值为1. 0, 2.0, 7.0,用醋酸乙酯按相比1 ： 1四级错流萃取，各自合并上相。用紫外测定产 品中的总绿原酸和总糖量。结果见表2。1四级错流萃取，各自合并上相。用紫外 测定产品中的总绿原酸和总糖量。结果见表2。表2不同ph条件下萃取测定结果（略）结果表明，ph小于

11、2的酸性条件下绿原酸的萃取收率高，表明绿原酸以分子 酸的形式更容易被萃取到有机相，但相应的产品中测到总糖含量也较高，分析认 为，除了由于粗提物中的部分多糖被混溶到有机相的水带进产品以外，粗提物中 的黄酮昔也被萃取到了有机相所致。2.4萃取时间对绿原酸收率的影响采用电磁搅拌装置考察醋酸乙酯对绿原酸 的萃取速率。结果见图1。图1表明，醋酸乙酯萃取绿原酸的过程为一快速过程, 3 min即已达到平衡，延长萃取时间对绿原酸收率影响不大，因此其余实验的萃 取时间均选择5 min。 图1萃取时间对绿原酸收率的影响（略）2.5多级萃取实验醋酸乙酯在原料液ph=l. 5的条件下萃取绿原酸的分配比 为069,在该

12、萃取条件下，根据萃取公式计算，当有机相和水相体积比等于1时, 进行n级萃取后，绿原酸的萃取回收率p=l-l/ （1+k） n,通过计算，当进行4 级萃取后绿原酸的萃取率可达87.74%。为此进行4级萃取实验：将50 g粗提粉 用100 ml水溶解后，调节ph=25,加入醋酸乙酯经过4级萃取，萃取液和萃余 液分别进行浓缩、冷冻干燥得到产品。精密称取样品进行分析检测。结果见表3。表3四级错流萃取测定结果（略）hplc分析结果得出，产品中绿原酸含量35.2%,收率为90.52%,实验值和理 论预测值吻合较好。根据绿原酸uv法分析结果，产品中绿原酸含量为69.1%,收 率为81.44%,这个结果比hp

13、lc法测定值偏高，表明产品中除绿原酸外还含有绿 原酸的异构体、异绿原酸、咖啡酸等在327 nm处也有紫外吸收的物质。2.6萃取产物成分鉴定将萃取产品进行lc-ms检测，液相流动相条件为：甲 醇-0.5%乙酸溶液（40 : 60 ）;检测波长为327 nm;柱温：25°c。图1所示为液相 的紫外图谱，产品中有7个含量较高的化合物，分别对应于7个峰，峰1, 2, 3,4, 5, 6, 7。其保留时间（tr）分别为 2. 260, 2.684, 3. 176, 3.709, 4. 831 ,5. 483, & 879 min,峰1至7分别所对应的化合物准分子离子峰m/z依次等于37

14、7, 377, 377, 391 , 539, 539, 539,均为m+na +峰，计算出对应化合物的分子量 分别为354, 354, 354, 368, 516, 516, 516。因此推断其中的峰1, 2, 3应归 属为绿原酸及其同分异构体（理论分子量354.30 ）,峰5、6、7归属为异绿原酸（理论分子量516. 44 ）。峰1,2,3的二级质谱图中，出现了离子峰m/z等于214. 9 的碎片离子峰（参看图3）,表明是绿原酸分子离子脱去咖啡酸后的奎尼酸。峰6 和7的二级质谱图中，出现了离子峰m/z等于377的碎片离子峰（参看图4）,表 明是异绿原酸分子离子脱去一分子咖啡酸所得。推测峰4为绿原酸甲酯。图2萃取产物的hplc-ms谱图分析结果示意图（略）图3组分2质谱图（略）图4组分6, 7的质谱图（略）3结论对金银花粗粉在醋酸乙酯-水体系中的萃取分配系数测定得d=0.69,表明醋 酸乙酯是萃取绿原酸的适用溶剂，ph小于2的酸性条件下绿原酸的萃取收率高。 实验结果表明，经过4级错流萃取，粗粉中将近90%的绿原酸被萃取到上相，所 得萃取产品中绿原酸的含量经uv检测为69. 1%,经hplc检测为35.2%。对醋酸 乙酯萃取产物做lc-ms检测，结果推断产品中含有绿原酸和异绿原酸。参考文