分子生物学实验原理

1、1分子生物学实验原理分子生物学实验原理2第一节 分子生物学发展概述分子生物学发展概述l分子生物学分子生物学molecular biology是在分子水平上是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。研究生物的结构、组织和功能的科学。l1950年，年，Astbury在一次学术报告中，首在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。次提出并使用了分子生物学这一名词术语。l广义和狭义之分广义和狭义之分l医学分子生物学医学分子生物学是应用分子生物学技术和是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理。及其调控的分子机理。

2、4分子生物学理论与实际应用的成就分子生物学理论与实际应用的成就理论方面理论方面1.关于肿瘤的发生：关于肿瘤的发生： 提出了肿瘤起源于提出了肿瘤起源于细胞增细胞增殖和分化调控的失常殖和分化调控的失常和细胞同它周围组织关系和细胞同它周围组织关系的紊乱。的紊乱。 癌基因：癌基因：100多种；抑癌基因：多种；抑癌基因：20多种多种 细胞周期调控系统细胞周期调控系统 细胞凋亡细胞凋亡 端粒酶端粒酶52.关于艾滋病关于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗序列；疫苗3.关于慢性病关于慢性病chronic disease，如心血管疾，如心血管疾病、肥

3、胖、糖尿病、骨质疏松，发现了病、肥胖、糖尿病、骨质疏松，发现了相关基因及其多态性。相关基因及其多态性。4.关于生长、发育与进化的统一理论，关于生长、发育与进化的统一理论，也深入到了分子水平。也深入到了分子水平。6实际应用方面实际应用方面1.转基因植物转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物的物的基因有基因有100多个多个。抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良环境因素环境因素（抗寒、抗盐碱地、抗旱、（抗寒、抗盐碱地、抗旱、抗涝）、提高作物的产量、抗涝）、提高作物的产量、提高蛋白提高蛋白质含量质含量、改善氨基酸构成等。、改善氨基酸构成

4、等。2.转基因动物转基因动物 1983年，年，超级小白鼠超级小白鼠，体重是正常鼠的，体重是正常鼠的2倍。随后出现转基因倍。随后出现转基因猪、羊、鸡、兔、猪、羊、鸡、兔、牛、鲤鱼牛、鲤鱼等。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、等。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆头鲂。圆头鲂。3.基因工程多肽药物与疫苗基因工程多肽药物与疫苗 主要指主要指DNADNA体外重组技术所研制的产品，体外重组技术所研制的产品，转基因动物和植物所研制的产品转基因动物和植物所研制的产品，以及，以及蛋蛋白质工程技术白质工程技术所研制或改进的产品。所研制或改进的产品。8 4.基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 基因诊断基因诊断gene dia

5、gnosis是指通过直接探查基是指通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断的方法。的方法。 目的物：目的物：DNA或或RNA 方法：方法：核酸分子杂交技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、技术、 DNA芯片技术芯片技术 疾病：疾病：遗传性疾病；传染病或感染性疾病遗传性疾病；传染病或感染性疾病9基因治疗基因治疗gene therapy 指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常表以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常表达的基因，以达到治疗疾病的目的。达的基因，以达到治疗疾病的目的。治疗

6、疾病：治疗疾病： 遗传病遗传病 恶性肿瘤恶性肿瘤 传染病传染病5.环境监测与净化环境监测与净化 area survey and depollution 监测：可检测环境中的监测：可检测环境中的病毒和细菌病毒和细菌 净化：改造细菌净化：改造细菌分解环境中的石油、残留的农药分解环境中的石油、残留的农药和有毒金属和有毒金属6.克隆动物克隆动物Clone animal 1997年年“多利多利”克隆羊克隆羊 克隆器官克隆器官（干细胞（干细胞stem cell技术）技术）7.人类基因组计划人类基因组计划human genome project;HGP1990年，年，美国国立卫生研究院（美国国立卫生研究院（

7、NIH） 和美国和美国能源部能源部联合发表了人类基因组计划。联合发表了人类基因组计划。30亿个碱基对亿个碱基对，估计有，估计有3万万4万个人类基因。万个人类基因。2000年年6月月26日，首次绘成人类基因组日，首次绘成人类基因组“工作工作框架图框架图” 。2003年年4月月14日，中、美、日、德、法、英等日，中、美、日、德、法、英等6国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制成功，成功，人类基因组计划的所有目标全部实现人类基因组计划的所有目标全部实现。 12 意意 义义与与“阿波罗阿波罗”登月计划相媲美登月计划相媲美1996年诺贝尔化学奖得主罗伯特年诺贝尔

8、化学奖得主罗伯特柯特认为，柯特认为，20世纪是物理学和化学的世纪，世纪是物理学和化学的世纪，21世纪将世纪将是生物学的世纪是生物学的世纪。推动分子生物学更加快速地发展：推动分子生物学更加快速地发展：蛋白质蛋白质组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学及各种及各种计划计划13对其他相关学科的影响对其他相关学科的影响1.向其他学科渗透向其他学科渗透2.形成了许多新兴的边缘学科形成了许多新兴的边缘学科 基础医学方面基础医学方面：肿瘤分子生物学、免疫分子生：肿瘤分子生物学、免疫分子生 物学、神经分子生物学等

9、物学、神经分子生物学等 预防医学方面预防医学方面：分子营养学、分子毒理学、分：分子营养学、分子毒理学、分 子流行病学、遗传流行病学、人子流行病学、遗传流行病学、人 类基因组流行病学、类基因组流行病学、 公共卫生公共卫生 遗传学遗传学14在预防医学中的应用及发展方向在预防医学中的应用及发展方向1.1.慢性病的研究慢性病的研究 慢性病的发病原因绝慢性病的发病原因绝大多数是大多数是基因与外界环境因素相互作用基因与外界环境因素相互作用的结果的结果。2.环境因素对人类遗传物质损伤的研究及环境因素对人类遗传物质损伤的研究及“三致三致”毒性的研究：毒性的研究：生物标志物的研生物标志物的研究和评价方法的建立究

10、和评价方法的建立3.环境监测与污染物的净化。环境监测与污染物的净化。4.4.遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊断（表型预防）。断（表型预防）。5.5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。 6.6.对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基因组计划（环境基因组学）基因组计划（环境基因组学） （1 1）环境应答反应基因）环境应答反应基因 （2 2）筛选多态性及易感性）筛选多态性及易感性 （3 3）根据易感性制定不同的干预计划）根据易感性制定不同的干预计划16一、分子生物学一些重要的理论知识

11、一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，年，“遗传学之父遗传学之父”G.Mendel根据根据豌豆杂交试验结果，豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说创立了遗传因子学说，即，即遗传的分离律和自由组合律。遗传的分离律和自由组合律。（2）1903年年W.Sutton提出提出染色体染色体是是Mendel遗遗传单位的载体的概念。传单位的载体的概念。（3）1909年，年，W.Johannsen将这种在染色体将这种在染色体上的遗传单位上的遗传单位定名为基因定名为基因（gene）。）。（4）1910年，现代实验遗传学奠基人年，现代实验

12、遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了传规律时发现了基因的连锁律和交换律基因的连锁律和交换律。（5）1944年，年，OT.Avery等人（等人（3人）分离人）分离出细菌出细菌 DNA，并发现，并发现DNA是携带生命遗传是携带生命遗传物质的分子。物质的分子。（6）1950年，年，Astbury在一次演讲中，首在一次演讲中，首次使用了次使用了 “分子生物学分子生物学” 术语术语。（7）1953年，年，Watson和和Crick提出了提出了DNA结构的结构的双螺旋模型双螺旋模型，揭示了遗传物质自我，揭示了遗传物质自我复制的机制。复制的机制。（

13、8）1961年至年至1966年，年，Nirenberg和和Crick 等人破译了等人破译了DNA遗传密码遗传密码，1966年年 破译了破译了64个遗传密码。个遗传密码。 提出了遗传信息由提出了遗传信息由DNA RNA蛋白蛋白质传递的质传递的中心法则中心法则。 （9）1969年，年，Jonathan Beckwith及其同及其同事在哈佛大学成功事在哈佛大学成功分离出第一个基因分离出第一个基因。（10）1970年，发现了年，发现了逆转录酶逆转录酶。（11）1961年，年，F.Jacob和和J.Monod提出了提出了乳糖操纵子学说乳糖操纵子学说。（12）自）自1946年起的年起的20年当中，陆续发现

14、年当中，陆续发现了许多了许多质粒质粒；1968年至年至1970年又发现了许年又发现了许多多限制性内切酶限制性内切酶，为，为DNA体外重组提供了体外重组提供了有利工具。有利工具。（13）1973年，年，重组重组DNA技术问世技术问世。（14）1986年，年，K.Mullis等建立了等建立了PCR技术技术（15）1990年，年，人类基因组计划。人类基因组计划。20 2.2.三个重要理论三个重要理论important theory(1)DNA(1)DNA的结构、复制、中心法则的结构、复制、中心法则基本构成单位是基本构成单位是核苷酸核苷酸核苷酸由核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸脱氧核糖、碱基和磷酸构成。构

15、成。碱基分别是碱基分别是腺嘌呤腺嘌呤 (A)(A)、鸟嘌呤、鸟嘌呤 (G)(G)、胸腺嘧啶胸腺嘧啶 (T)(T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)(C)。相邻的两个核苷酸以相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键相连相连进一步盘旋、折叠，形成进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结三级或四级结构构RNARNA与与DNADNA有如下不同点有如下不同点：u五碳糖为五碳糖为核糖核糖( (不是脱氧核糖不是脱氧核糖) )；u碱基中有碱基中有尿嘧啶尿嘧啶U(uracil)U(uracil)而没有胸腺嘧而没有胸腺嘧啶啶uRNARNA为为单链单链，不是双链，但，不是双链，但RNARNA单链之间单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局

16、部双链。相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 uDNADNA存在于细胞核的染色体、线粒体存在于细胞核的染色体、线粒体以及以及染色体以外的质粒中染色体以外的质粒中( (质粒是一些双链，闭质粒是一些双链，闭环的环的DNADNA分子分子) )。22 DNA(DNA(或或RNA) RNA) 结构给我们的启示结构给我们的启示 DNA(DNA(或或RNA)RNA)是是水溶性的水溶性的。这是由于含有。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们中，我们保留的是水相、而不是有机相保留的是水相、而不是有机相。核酸是核酸是两性电离两性电离，既带正电荷，又带负，既带正

17、电荷，又带负电荷。它的等电点电荷。它的等电点(PI)(PI)为为2 22.52.5。在中性。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点电泳时，点样时应点在负极样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，；杂交时选择尼龙膜时，最好最好选择带正电荷的尼龙膜选择带正电荷的尼龙膜。( (核酸带负电荷，核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉) ) DNADNA在细胞中存在部位不同在细胞中存在部位不同( (细胞核、线粒细胞核、线粒体、质粒体、质粒) )，所以应注意提取方法的不同，所以应注意提取方法的不同 由于由于DNADNA空间构象不同空间

18、构象不同，在电泳时迁移率，在电泳时迁移率不同。不同。根据根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则，可设计引物和探，可设计引物和探针杂交。针杂交。由于由于DNADNA的双螺旋结构和的双螺旋结构和RNARNA易由于分子内易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。应加热变性，破坏二级结构。l 在在解旋酶解旋酶的作用下，打开的作用下，打开DNADNA双链双链 l 在特定的在特定的复制起始点复制起始点l 以每条以每条DNADNA链为链为模板模板l 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下l 以以4 4种脱氧核

19、苷酸种脱氧核苷酸为前体物，合成为前体物，合成一条互补一条互补DNADNA链。链。DNADNA的复制双称为半保留复制。的复制双称为半保留复制。DNA的复制的复制25DNA在复制起始点，由解旋酶打开双链，在复制起始点，由解旋酶打开双链，形成复制叉，形成复制叉，合成新链的合成新链的方向为方向为5-35-3端端前导链与后随链前导链与后随链后随链的合成是不连续的后随链的合成是不连续的。 先合成先合成RNARNA引物引物 再合成不连续的小片段再合成不连续的小片段( (冈崎片段冈崎片段，10010010001000核苷酸长度核苷酸长度) ) 最后在最后在DNADNA连接酶连接酶作用下，将小片段连作用下，将小

20、片段连接起，形成完整的接起，形成完整的DNADNA链。链。 27DNA 半半 不不 连连 续续 复复 制制DNADNA的复制给了我们一些启示的复制给了我们一些启示 PCR PCR技术的原理：在体外要靠温度技术的原理：在体外要靠温度(90(90以上以上) )打双链，而不是解旋酶，也是以打双链，而不是解旋酶，也是以DNADNA为为模，需要引物，需模，需要引物，需DNADNA聚合酶，需要聚合酶，需要dNTPdNTP为为前体。前体。PCRPCR与体内与体内( (细胞内细胞内)DNA)DNA复制的最大差复制的最大差异是温度异是温度。检测核分裂指数：在细胞培养中，检测核分裂指数：在细胞培养中，加入加入3

21、3H H标记的标记的dNTPdNTP前体物前体物，被细胞摄取后，参与，被细胞摄取后，参与DNADNA复制，复制速度越快，参入的复制，复制速度越快，参入的3 3H H标记的标记的dNTPdNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。据此判断。29p遗传信息的传递是：遗传信息的传递是： DNARNADNARNA多肽多肽( (蛋白质蛋白质) )p在逆转录酶的作用下，在逆转录酶的作用下，RNARNA可形成可形成cDNAcDNA，然后再由然后再由RNARNA蛋白质蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达为基因的表达

22、(expression)(expression)。中心法则中心法则30中中 心心 法法 则则31 转录转录(transcription)(transcription) 以以DNADNA为模板，合成为模板，合成RNARNA的过程。的过程。 非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。 转录的过程大致是这样的：转录的过程大致是这样的：u 以以DNADNA一条链为一条链为模板模板，u 诱导诱导RNARNA聚合酶活性、聚合酶活性、RNARNA聚合酶识别聚合酶识别并结合在并结合在转录起始位点转录起始位点u 以以ATPATP、GTPGTP、CTPCTP和和UTPUTP

23、为前体，为前体，合成合成( (转录转录)RNA)RNAu 当遇到转录当遇到转录终止信号时，转录即停止终止信号时，转录即停止。有意义链有意义链反义链反义链转录后的初级产物转录后的初级产物剪切掉内含子剪切掉内含子，并将外显，并将外显子连接起来，这样才能变成成熟的子连接起来，这样才能变成成熟的RNARNA分子分子还需要在还需要在5-5-端加一个特殊的核苷酸，端加一个特殊的核苷酸，7-7-甲甲基鸟嘌呤核苷酸基鸟嘌呤核苷酸，这个过程叫戴帽，这个过程叫戴帽另外，另外，mRNAmRNA的，这一过程又叫穿靴，的，这一过程又叫穿靴， 3-3-端还要加上一串腺苷酸端还要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)(AM

24、P)poly(A)或多聚腺或多聚腺苷酸化。苷酸化。同一机体不同的细胞具有相同的同一机体不同的细胞具有相同的DNADNA或基因，或基因，但但基因在不同细胞的表达是不同的基因在不同细胞的表达是不同的，具有组织，具有组织特异性，使不同的细胞具有不同的功能特异性，使不同的细胞具有不同的功能由由RNA RNA 蛋白质的过程，又叫翻译蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合。只有聚合酶酶IIII催化的反应产物是催化的反应产物是mRNAmRNA，而只有，而只有mRNAmRNA才翻译才翻译成蛋白质。成蛋白质。基因基因(DNA)(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子上三个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子决定一种特

25、定的氨基酸，共有一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有4 43 3=64=64个个密码子。密码子。在转录过程中，基因上的三联密码子转录成在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNAmRNA上的三联密码子。上的三联密码子。mRNAmRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三三联密码子指导合成蛋白质联密码子指导合成蛋白质。翻译后的翻译后的蛋白质需要加工修饰蛋白质需要加工修饰。 35中心法则给了我们一些启示：中心法则给了我们一些启示：遗传信息由遗传信息由DNADNA上的基因决定。上的基因决定。一旦基一旦基因发生突变因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质，将最终导致所翻

26、译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。出现疾病，如癌症、肥胖等。 mRNAmRNA更能准确简便地反映更能准确简便地反映DNADNA上基因所上基因所携带的遗传信息携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，。因此对基因序列的分析，常分析常分析mRNAmRNA的序列即可。的序列即可。 基因的表达有组织特异性基因的表达有组织特异性，且受许多因，且受许多因素的影响，使素的影响，使mRNAmRNA的表达增强、降低甚至的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。出现疾病。因此因此常需要

27、检测常需要检测mRNAmRNA的表达的丰度的表达的丰度( (含量含量) )，常用方法有常用方法有NorthernblotNorthernblot、RT-PCRRT-PCR。定量。定量(Real time)PCR(Real time)PCR等。等。这里需要特别强调：在检测这里需要特别强调：在检测mRNA(mRNA(或蛋白或蛋白) )表达时，表达时，一定要先弄清该基因在某种组织一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达中是否有表达。 根据中心法则，可以根据中心法则，可以RNARNA为模板，在逆为模板，在逆转录酶作用下形成转录酶作用下形成cDNAcDNA，于是建立了，于是建立了RT-RT-PCRPCR

28、的方法的方法。 根据根据mRNAmRNA的的33端有端有poly(A)poly(A)的特点，在的特点，在进行进行反转录时反转录时，就以，就以poly(A)poly(A)为模板设计为模板设计了引物。并且了引物。并且纯化纯化mRNAmRNA的方法的方法，也是根据，也是根据poly(A)poly(A)的原理设计的。的原理设计的。根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立立不同的蛋白质提取方法不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。 38（2 2）基因表达调控）基因表达调控 以乳糖操纵子学说为例以乳糖操

29、纵子学说为例 乳糖操纵子的基本组成元件乳糖操纵子的基本组成元件 调节基因调节基因 结构基因结构基因 I I P P O O 抑制基因抑制基因(I) ：是阻遏物编码区：是阻遏物编码区启动基因启动基因(P) (P) ：有有cAMPcAMP受体蛋白受体蛋白(CRP) (CRP) 和和RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点操纵基因操纵基因(O)：是阻遏物结合位点：是阻遏物结合位点 ：-半乳糖苷酶结构基因半乳糖苷酶结构基因：透过酶结构基因：透过酶结构基因：转乙酰酶的结构基因：转乙酰酶的结构基因调节方式调节方式 当乳糖当乳糖时时,cAMP,cAMP含量增高含量增高 cAMP cAMP与与CAP CA

30、P ( (分解产物激活剂蛋白分解产物激活剂蛋白) )结合成结合成CRPCRP该复合物与该复合物与启动基因上对应的位点结合启动基因上对应的位点结合后后使使DNADNA双链不稳定；随后双链不稳定；随后RNARNA聚合酶则容易聚合酶则容易与启动基因紧密结合；与启动基因紧密结合；若此时操纵基因上无若此时操纵基因上无阻遏物阻遏物，则，则基因被打开基因被打开RNARNA聚合酶从聚合酶从DNADNA的的55端开始滑动，即端开始滑动，即开始开始转录转录，并合成了，并合成了3 3种酶。种酶。40当葡萄糖当葡萄糖cAMPCRPRNA聚合酶则不能与启动基因结合，也聚合酶则不能与启动基因结合，也就不能转录和合成就不能

31、转录和合成3种酶。种酶。p抑制基因转录和翻译成抑制基因转录和翻译成阻碍蛋白阻碍蛋白，并与，并与操纵基因结合操纵基因结合,阻止阻止RNA聚合酶滑动而抑聚合酶滑动而抑制转录。这种情况又称为负调节制转录。这种情况又称为负调节p如果如果阻遏蛋白与诱导物结合阻遏蛋白与诱导物结合(此处为乳此处为乳糖糖) 。则这个复合物不能与操纵基因结合，。则这个复合物不能与操纵基因结合，转录和翻译就能进行。转录和翻译就能进行。 41u操纵子学说操纵子学说扩大了基因的概念扩大了基因的概念。即结。即结构基因和调节基因构基因和调节基因u调节基因发挥正、负调节受细胞内外调节基因发挥正、负调节受细胞内外环境因素的影响。环境因素的影

32、响。形成了基因调控和表形成了基因调控和表达的概念达的概念。u基因表达调控理论，不仅有助于理解基因表达调控理论，不仅有助于理解生命现象的本质，而且生命现象的本质，而且对基因工程对基因工程的建的建立是至关重要。立是至关重要。 （3 3）DNADNA重组重组( (基因工程基因工程) )基因工程的两个重要工具：基因工程的两个重要工具：n一是一是内切酶内切酶，能特异地识别，能特异地识别DNADNA的碱基序列，的碱基序列，并在并在DNADNA链当中将链当中将DNADNA切开。切开。n二是二是载体载体，如质粒、噬菌体、病毒。，如质粒、噬菌体、病毒。载体的共同特点：载体的共同特点： 环状环状DNADNA；都能

33、专一；都能专一感染某一类细胞感染某一类细胞；具有；具有某种某种选择性标记选择性标记；都具有一些；都具有一些内切酶位点内切酶位点；都能随着染色体的复制而都能随着染色体的复制而复制复制，随着细胞分，随着细胞分裂而裂而扩增扩增。 43基因工程的基本程序：基因工程的基本程序： 取得所需要的目的基因；取得所需要的目的基因； 将目的基因同载体连接；将目的基因同载体连接； 再将这个重组环状再将这个重组环状DNA引入受体引入受体细胞细胞(或称寄主细胞或称寄主细胞)； 使目的基因得以表达，即基因转使目的基因得以表达，即基因转录和翻译成蛋白质。录和翻译成蛋白质。44第二节 核酸的提取技术核酸的提取技术extrac

34、tive technique of nucleic acid 45 1. 结合状态结合状态 2.形态：分线形和环形；分双链和单链形态：分线形和环形；分双链和单链 3.分布：分布： DNA分布在细胞核和细胞；分布在细胞核和细胞； RNA 分布在细胞质、细胞核和细胞器分布在细胞质、细胞核和细胞器（一）核酸在细胞中的存在状态和分布（一）核酸在细胞中的存在状态和分布（二）二）核酸分离提取的原则、要求核酸分离提取的原则、要求 1.1.原则：原则：(1)(1)应保证应保证核酸一级结构的完整性核酸一级结构的完整性； (2)(2)排除其它分子的污染，排除其它分子的污染，纯度要高纯度要高。 2.2.对于核酸纯度

35、的要求：对于核酸纯度的要求： (1)(1)对于核酸样品中不应存在对酶有抑制作用对于核酸样品中不应存在对酶有抑制作用 的的有机溶剂和过高浓度的金属离子有机溶剂和过高浓度的金属离子； (2)(2)其它生物大分子如其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子蛋白质、多糖和脂类分子 污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度； (3)(3)排降其它核酸分子的污染排降其它核酸分子的污染，如提取，如提取DNADNA时，时， 应去除应去除RNARNA，反之亦然。，反之亦然。 3.3.注意事项注意事项 (1)(1)尽量尽量简化操作步骤简化操作步骤，缩短提取过程，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏以减少各种

36、有害因素对核酸的破坏(2)(2)减少减少化学因素化学因素对核酸的降解，为避对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的 破坏，操作多在破坏，操作多在pH4pH41010条件下进行。条件下进行。(3)(3)减少减少物理因素物理因素对核酸的降解。物理对核酸的降解。物理因素主要是机械剪切力，其次是高温。因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力主要来源于溶液的快速振荡，机械剪切力主要来源于溶液的快速振荡，搅拌等。常规操作温度为搅拌等。常规操作温度为0 044。(4)(4)避免避免生物因素生物因素对核酸的降解。细胞对核酸的降解。细胞内外均存在核酸酶，尤其是内

37、外均存在核酸酶，尤其是RNARNA酶存在酶存在广泛、稳定，极易降解核酸。因此提取广泛、稳定，极易降解核酸。因此提取过程中，应注意采用核酸酶抑制剂和破过程中，应注意采用核酸酶抑制剂和破坏方法。坏方法。 ( (三三)DNA)DNA的提取、纯化的提取、纯化 真核细胞染色体真核细胞染色体DNADNA的制备的制备( (提取、纯化提取、纯化) ) 根据不同的实验要求，可有不同的根据不同的实验要求，可有不同的DNADNA提提取方法，如取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒缠绕法，异丙醇沉淀法棒缠绕法，异丙醇沉淀法等。但这些方法在等。但这些方法在基本原理及大致步骤上是基本相同的。

38、而且基本原理及大致步骤上是基本相同的。而且酚抽提法比较经典常用酚抽提法比较经典常用，下面就以此方法为，下面就以此方法为例进行介绍。例进行介绍。50 酚抽提法酚抽提法 酚抽提法的酚抽提法的基本原理基本原理：u用用SDSSDS和蛋白酶和蛋白酶K K破坏和消化细胞破坏和消化细胞u用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质u通过盐和乙醇沉淀获得通过盐和乙醇沉淀获得DNADNA。 试剂：试剂： 1 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液PBSPBS 2 DNA 2 DNA抽提缓冲液：抽提缓冲液： 10mmol/L Tris.cl (10mmol/L Tris.cl (缓冲溶液的缓冲溶液的pH

39、pH值值，pH8.0)pH8.0)。 0.1mol/L EDTA(0.1mol/L EDTA(金属离子络合剂金属离子络合剂，可，可抑制抑制DNADNA聚合聚合酶活性酶活性) )。 20g/ml 20g/ml 胰胰RNARNA酶酶( (破坏降解破坏降解RNARNA) ) 0.5% SDS( 0.5% SDS(表面活性剂，表面活性剂，破坏细胞破坏细胞) 。 蛋白酶蛋白酶K (K (消化细胞、消化细胞、破坏细胞破坏细胞) )320mg/ml蛋白酶蛋白酶K，消化细胞，破坏细胞，消化细胞，破坏细胞4酚（用酚（用0.5 mol/L TrisCl，pH 8.0饱和），饱和），主要作用是主要作用是沉淀蛋白质沉

40、淀蛋白质等等510 mol/L NH4Ac，其作用是，其作用是沉淀沉淀DNA6乙醇，其作用是乙醇，其作用是沉淀沉淀DNA7TE（Tris和和EDTA混合液），是混合液），是溶解保存溶解保存DNA的最好溶液的最好溶液8透析液：透析液： 50 mmol/L TrisCl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.053 样品前处理样品前处理 (1)(1)生物组织：生物组织：新鲜的生物组织，先新鲜的生物组织，先用剪切刀清除组织中筋膜等结缔组织，吸用剪切刀清除组织中筋膜等结缔组织，吸干血液。若不能马上进行干血液。若不能马上进行DNADNA提取，可将提取，可将生物组织贮存于生物组织贮存于液氮

41、中或液氮中或-70-70冰箱中冰箱中。a.a.取取1 13g3g左右的组织，用左右的组织，用8 8层纱布包好，层纱布包好，外层再包多层牛皮纸，浸入液氮中使组织外层再包多层牛皮纸，浸入液氮中使组织结冻，取出后用结冻，取出后用木锤将其敲碎木锤将其敲碎。b.b.将敲碎的组织放入搪瓷研钵中，加入少将敲碎的组织放入搪瓷研钵中，加入少许液氮，用许液氮，用研杵碾磨研杵碾磨。需。需反复添加液氮反复添加液氮。C.C.在离心管中在离心管中加入加入10ml DNA10ml DNA抽提液抽提液，用玻璃，用玻璃棒边搅动边加入组织粉末，然后棒边搅动边加入组织粉末，然后3737保温保温1 1小小时。时。( (先加抽提液，后

42、加组织粉末，有利于充先加抽提液，后加组织粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金属棒，分溶解，用玻璃棒而不用金属棒，减小损伤减小损伤DNADNA的机率的机率，3737保温保温1 1小时，一方面有利于小时，一方面有利于SDSSDS破坏细胞，更主要是为了使溶液平衡温度破坏细胞，更主要是为了使溶液平衡温度达到达到3737，为下一步反应准备适宜条件，为下一步反应准备适宜条件) )。 (2)(2)培养的细胞培养的细胞 a.a.收集细胞收集细胞，悬浮培养，悬浮培养( (生长生长) )的细胞；的细胞；可以直接经可以直接经1500g1500g离心离心(4,10(4,10分钟分钟) )，以收，以收集细胞；贴壁生长

43、的细胞，用胰酶消化后集细胞；贴壁生长的细胞，用胰酶消化后再离心收集。再离心收集。细胞数应在细胞数应在5 510107 7左右左右。 b.b.漂洗细胞漂洗细胞，将离心沉淀的细胞用冰预，将离心沉淀的细胞用冰预冷的冷的PBSPBS液或生理盐水，漂洗液或生理盐水，漂洗1 1次再离心，次再离心，弃上清收集细胞。可重复漂洗弃上清收集细胞。可重复漂洗1-21-2次次( (目的目的去除培养液成分和细胞分泌的蛋白去除培养液成分和细胞分泌的蛋白) ) c.c.保温保温，再用，再用10ml DNA10ml DNA抽提液将细胞沉抽提液将细胞沉淀悬浮，并在淀悬浮，并在3737保温保温1 1小时。小时。56 (1)(1)

44、消化消化 向上述预处理好的样品溶液中向上述预处理好的样品溶液中( (样品溶解在样品溶解在DNADNA抽提液并保温抽提液并保温1 1小时小时) )，加，加入入20mg/ml20mg/ml的蛋白酶的蛋白酶K K，至终浓度为，至终浓度为100g/ml100g/ml，边加边用玻璃棒轻轻搅拌，使，边加边用玻璃棒轻轻搅拌，使溶液至粘稠状溶液至粘稠状( (细胞破裂，蛋白、核酸释细胞破裂，蛋白、核酸释放放) )。将反应液在。将反应液在5050水浴上，保温水浴上，保温3h3h，裂，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时轻轻摇匀反应液。轻轻摇匀反应液。 DNADNA提取步骤提取

45、步骤(2)(2)加酚混匀加酚混匀 将反应液冷却至室温，加入等将反应液冷却至室温，加入等容积容积已饱和的酚溶液已饱和的酚溶液，轻轻地上下转动离心，轻轻地上下转动离心管，混匀两相，反复该动作管，混匀两相，反复该动作10min10min，直至水相，直至水相与酚相混匀并成乳状液。若没有达到这种效与酚相混匀并成乳状液。若没有达到这种效果，可用多角度振荡器温和地混匀果，可用多角度振荡器温和地混匀1 1小时小时(3)(3)离心离心 室温室温5000g5000g，离心，离心15min15min，使两相分，使两相分开开( (水相在上层，酚相在下层水相在上层，酚相在下层) )，(DNA(DNA在水相，在水相，因水

46、溶性，带负电荷因水溶性，带负电荷) )。(4)(4)取上层水相用酚重复抽提两次，取上层水取上层水相用酚重复抽提两次，取上层水相时，应用大口径相时，应用大口径(0.3cm)(0.3cm)吸管，因水相粘稠吸管，因水相粘稠 (5)(5)又分两种情况又分两种情况 a.a.透析处理：为提取大分子量透析处理：为提取大分子量DNA(200KbDNA(200Kb以上以上) )，在，在第第3 3次酚抽提后，将次酚抽提后，将DNADNA溶液装入透析袋中，并放入溶液装入透析袋中，并放入44透析液中。每次透析液透析液中。每次透析液1 1升，换升，换4 4次透析液，直至次透析液，直至透析物透析物ODOD270270小于

47、小于0.050.05，才算透析完毕。，才算透析完毕。b.b.沉淀处理，对于沉淀处理，对于100100150Kb150Kb大小的大小的DNADNA提取，在第提取，在第三次酚抽提后，将上层水相移入一个新的离心管中，三次酚抽提后，将上层水相移入一个新的离心管中，加入加入0.20.2倍容积的倍容积的10mol/L10mol/L乙酸铵乙酸铵和和2 2倍容积倍容积95%95%乙醇。乙醇。室温下轻轻摇动，立刻就可看到乳白色丝状沉淀出现，室温下轻轻摇动，立刻就可看到乳白色丝状沉淀出现，用一个前端为钩状的玻璃棒用一个前端为钩状的玻璃棒( (挑挑) )出出DNADNA纤维，立即放纤维，立即放入入70%70%乙醇中

48、漂洗乙醇中漂洗2 2次次。室温。室温5000g5000g，离心，离心5min5min，弃上，弃上清。室温下挥发残留乙醇。但注意不要使清。室温下挥发残留乙醇。但注意不要使DNADNA沉淀完沉淀完全干燥。然后加全干燥。然后加TE(pH8.0)TE(pH8.0)溶解溶解DNA 12DNA 1224h24h 。(6)(6)测定样品在测定样品在260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值，值，计算计算DNADNA含量和含量和A260/A280A260/A280比值。比值。 260nm260nm处，是核酸的最大吸收波长，处，是核酸的最大吸收波长，在在280nm280nm处是蛋白质最大吸收波长

49、。处是蛋白质最大吸收波长。 在在260nm260nm紫外线下，紫外线下，1OD1OD的光密度值相的光密度值相当于双链当于双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链单链DNADNA或或RNARNA为为40g/ml40g/ml。因此根据核酸的。因此根据核酸的ODOD值，计算核酸样品的浓度或含量。值，计算核酸样品的浓度或含量。n根据根据A260A260/A280A280比值，可判断所提取核酸比值，可判断所提取核酸(DNA)(DNA)的的纯度。纯度。DNADNA纯度比较理想的比值是纯度比较理想的比值是1.81.8，RNARNA比值是比值是2.02.0。若。若DNADNA比值比值高于高于

50、1.81.8，说明有，说明有RNARNA的污染的污染，低低于于1.81.8或或1.751.75，则认为是蛋白质或酚污染，则认为是蛋白质或酚污染。RNARNA比比值小于值小于2.02.0，则认为也是蛋白质或酚的污染。，则认为也是蛋白质或酚的污染。nDNADNA样品纯度不符合要求样品纯度不符合要求( (尤其是尤其是A260/A280A260/A280比值比值小于小于1.81.8时时) ) 可用酚或酚可用酚或酚/ /氯仿和氯仿抽提氯仿和氯仿抽提2-32-3次，次， 用乙醚除去残留氯仿，再挥掉乙醚。用乙醚除去残留氯仿，再挥掉乙醚。 最后用盐和乙醇沉淀，用最后用盐和乙醇沉淀，用TETE溶解。溶解。61

51、本方法需要说明的几点：本方法需要说明的几点：(1) 5(1) 510107 7细胞提取产量为细胞提取产量为200g200g左右。左右。(2)(2)对于上层水相比较粘稠，吸取上层水相时，对于上层水相比较粘稠，吸取上层水相时，会牵动两相之间的蛋白质沉淀层。此时可用吸会牵动两相之间的蛋白质沉淀层。此时可用吸管插到管底吸取酚相管插到管底吸取酚相( (采用负压采用负压) )，至蛋白质层，至蛋白质层时，停止。并离心时，停止。并离心(5000g,20(5000g,20分钟分钟) )，沉淀蛋白，沉淀蛋白质，吸取上清液。质，吸取上清液。(3)(3)由于由于0.5% 0.5% SDSSDS的存在的存在，可抑制部分

52、胰，可抑制部分胰RNARNA酶酶活性，故活性，故应加大该酶用量应加大该酶用量，一般为，一般为20 g/ml20 g/ml(4)(4)所用酚，所用酚，应重蒸酚，并用水饱和应重蒸酚，并用水饱和。62（四）（四）RNA的分离与纯化的分离与纯化1. 1. 创造一个无创造一个无RNARNA酶酶(RNase)(RNase)的环境的环境RNARNA酶酶在环境中无处不在在环境中无处不在：空气中灰尘、：空气中灰尘、微生物，人体汗液、唾液，以及各种器皿微生物，人体汗液、唾液，以及各种器皿和试剂等，均存在和试剂等，均存在RNase RNase 。RNaseRNase非常稳定非常稳定，耐热、耐酸，耐碱。蛋，耐热、耐酸

53、，耐碱。蛋白质变性剂可使之暂时失活。白质变性剂可使之暂时失活。 RNaseRNase活性活性不需要辅助因子不需要辅助因子，因此，因此EDTAEDTA对对此酶无抑制作用。此酶无抑制作用。 (1)(1)去除外源性去除外源性RNaseRNase的污染的污染空气中的细菌、霉菌等微生物都含有空气中的细菌、霉菌等微生物都含有RNaseRNase，所以整个操作过程应所以整个操作过程应在比较清洁的环境中进在比较清洁的环境中进行行。因此有必要对操作场所的空气进行消毒。因此有必要对操作场所的空气进行消毒。操作者操作应操作者操作应戴口罩和手套、带帽子戴口罩和手套、带帽子。玻璃器皿玻璃器皿常规洗净后，应用常规洗净后，

54、应用0.1%DEPC(0.1%DEPC(二乙二乙基焦碳酸盐基焦碳酸盐) )浸泡处理浸泡处理(37(37，2h)2h)，再用灭菌，再用灭菌去离子水漂洗几次。高压消毒去除去离子水漂洗几次。高压消毒去除DEPCDEPC，然，然后后250250烘烤烘烤4h4h以上或以上或200200干烤过夜。干烤过夜。塑料器材最好使用塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料灭菌的一次性塑料用用品。品。EppendorfEppendorf管，微量加样吸头最好是新管，微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压消毒。的，使用前进行高压消毒。所有所有溶液应加溶液应加DEPCDEPC至至0.05-0.1%0.05-0.1%，室温过室温过夜

55、，然后高压消毒。以去除残留的夜，然后高压消毒。以去除残留的DEPCDEPC。RNARNA提取所用的酚，应单独配制和使用。提取所用的酚，应单独配制和使用。配制饱和酚盐溶液时，使用的水应预先以配制饱和酚盐溶液时，使用的水应预先以DEPCDEPC处理且高压消毒，处理且高压消毒，酚饱和以后，加入酚饱和以后，加入8-8-羟基喹啉至羟基喹啉至0.1%0.1%。8-8-羟喹啉不但抗氧化，羟喹啉不但抗氧化，而且有一定的而且有一定的RNARNA酶抑制作用。酶抑制作用。 DEPCDEPC的分子式为的分子式为C C2 2H H5 5-O-CO-O-CO-O-C-O-CO-O-CO-O-C2 2H H5 5二乙基二乙

56、基焦碳酸盐焦碳酸盐。是一种粘性液体，对核酸酶有很强的。是一种粘性液体，对核酸酶有很强的抑制作用。抑制作用。作用机制是通过作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合与蛋白质中的组氨酸结合，使，使蛋白质变性。蛋白质变性。DEPCDEPC又能与又能与RNARNA或单链或单链DNADNA反应，反应，破坏单链核酸破坏单链核酸中大部分腺嘌呤，中大部分腺嘌呤，但它破坏单链核酸的浓度要比但它破坏单链核酸的浓度要比使蛋白质变性的使蛋白质变性的浓度大浓度大100-1000100-1000倍倍。使用使用DEPCDEPC的一个原则是，在达到使用目的后，的一个原则是，在达到使用目的后，一般要一般要高温处理以便破坏除掉高温处理

57、以便破坏除掉DEPCDEPC，使，使DEPCDEPC不与不与RNARNA接触。接触。 pDEPCDEPC可可与与TrisTris发生反应，分解成发生反应，分解成COCO2 2和乙和乙醇醇，使，使pHpH值下降值下降（所以要去除）（所以要去除）p配制配制TrisTris溶液时，先将溶液时，先将所用水用所用水用DEPCDEPC处处理高压消毒理高压消毒p配完配完TrisTris溶液后，再经高压消毒。溶液后，再经高压消毒。pDEPCDEPC与肝素联合使用与肝素联合使用，增强使用效果。，增强使用效果。pDEPCDEPC应在应在44或液氮中保存，以防降解。或液氮中保存，以防降解。 (2)(2)抑制内源性抑

58、制内源性RNaseRNase的活性的活性。细胞裂碎的同时，细胞裂碎的同时，RNaseRNase释放出来。释放出来。原则上应原则上应尽早去除细胞内蛋白尽早去除细胞内蛋白，加入，加入RNaseRNase抑制剂，力争在提取的起始阶段对抑制剂，力争在提取的起始阶段对RNaseRNase活力进行有效地抑制。活力进行有效地抑制。不同组织细胞中内源性不同组织细胞中内源性RNaseRNase的数量不同，的数量不同，胰腺、脾组织胰腺、脾组织细胞中细胞中RNaseRNase的含量极为丰富，的含量极为丰富，在对这些组织提取在对这些组织提取RNARNA时，更要使用强有力时，更要使用强有力的的RNaseRNase抑制剂

59、。抑制剂。 抑制剂可分为以下几类：抑制剂可分为以下几类： 低特异性低特异性RNaseRNase抑制剂，如抑制剂，如皂土、复合硅酸皂土、复合硅酸盐、肝素、多胺盐、肝素、多胺等，因作用较弱，现已不大等，因作用较弱，现已不大使用。使用。去除蛋白质物质去除蛋白质物质 蛋白质变性剂蛋白质变性剂，蛋白，蛋白K K、阴离子去污剂，、阴离子去污剂，常常与与RNARNA酶抑制剂联合使用酶抑制剂联合使用，以加强对，以加强对RNaseRNase的的抑制作用。凡能破坏蛋白质的物质，对抑制作用。凡能破坏蛋白质的物质，对RNaseRNase均有一定作用，因为酶本身就是蛋白质。均有一定作用，因为酶本身就是蛋白质。 a.a.

60、酚、氯仿酚、氯仿 这类有机溶剂这类有机溶剂不但能使核蛋白与核不但能使核蛋白与核酸解聚酸解聚( (但不能破坏核酸但不能破坏核酸) )，而且对蛋白质有变性，而且对蛋白质有变性作用。因而对酶作用。因而对酶(RNase)(RNase)有抑制作用。有抑制作用。酚不能完酚不能完全抑制全抑制RNaseRNase活性，但酚一般都加入了活性，但酚一般都加入了8 8羟基喹羟基喹啉啉( (一种抗氧化剂，一种指示剂一种抗氧化剂，一种指示剂) )，因而加强了对，因而加强了对RNaseRNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比较强，因的抑制效果。氯仿的抑制效果比较强，因此酚与氯仿常联合使用。此酚与氯仿常联合使用。 蛋白酶蛋白