目的基因获得学习教案

1、会计学1目的目的(md)基因获得基因获得第一页，共103页。 三、目的(md)基因的获得限制酶酶切直接分离法PCR扩增法从mRNA合成cDNA化学合成法通过(tnggu)构建基因文库分离法第1页/共103页第二页，共103页。 对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制(xinzh)酶识别序列，选择适当的限制(xinzh)酶酶切，获得目的基因。（一）限制(xinzh)酶酶切直接分离法注意( z h y)： 目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！第2页/共103页第三页，共103页。Ampr5AOX1HIS4Kanr3AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF16

2、5EcoR INot IBgl IIhVEGF165Bgl II9.8 KbTTSAmpr5 AOX1HIS4Kanr3 AOX1ColE1 pPIC9K 9.3 KbBgl IIBgl IISnaB IEcoR IAvr IINot ISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5 Kb第3页/共103页第四页，共103页。 （二）PCR法扩增目的(md)基因 利用耐热(nai r)DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。PCR(polymerase chain reaction)：第4页/共

3、103页第五页，共103页。以 目 的 基 因 为 模 板(mbn)，合成互补的新DNA链。双链DNA解链为单链DNA； 引 物 与 模 板 单 链DNA的特定(tdng)互补部位配对、结合；退火(tu hu)：变性：延伸：变性退火延伸第5页/共103页第六页，共103页。 30th cycle？ 由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板(mbn)，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n (n为循环次数)。230(109)copies第6页/共103页第七页，共103页。PCR技术(jsh)的发明-DNA操作技术(jsh)的革命发明人：美国生化学家Kary B. MullisTh

4、e Nobel Prize in Chemistry 1993 Mullis KB. The unusual origin of the p o l y m e r a s e c h a i n reaction. Scientific American. 1990,262(4):56-61,64-5.1990.04Mullis KB. Dancing naked in the mind fields.1998.04第7页/共103页第八页，共103页。1983.03 开汽车时的联想： 蜿蜒崎岖(qq)的山路-DNA双螺旋 行驶的汽车-一小段DNA引物1972 在加州大学伯克利分校获得博士学

5、位1979 进入私人生物技术(jsh)公司Cetus 1983.08 正式做有关PCR原理(yunl)的报告1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑 第8页/共103页第九页，共103页。1985.03 Cetus公司(n s)申请专利 1985.12 Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic seq

6、uences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985,230(4732):1350-4. 1986.05 冷泉港“人类(rnli)分子生物学”专题研讨会 1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.第9页/共103页第十页，共1

7、03页。1991.12 Cetus以$3亿将专利(zhunl)卖给Hoffmann-La Roche公司 1986.06 Saiki等将耐热(nai r)DNA聚合酶-Taq酶引入PCR技术。Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988,239(4839):487-91. 1988

8、.011989 Science杂志(zzh)将PCR列为十余项重大科学发明之首， 比喻1989年为PCR爆炸年。1986.09 Mullis离开Cetus公司第10页/共103页第十一页，共103页。Eppendorf Bio-rad ABI第11页/共103页第十二页，共103页。PCR法扩增目的基因(jyn)的前提： 已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补(h b)的上、下游引物。 第12页/共103页第十三页，共103页。 Taq酶无35外切(wi qi)酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25。措施(cush)：问题(wnt)： 可

9、能造成目的基因碱基序列的改变。原因：选择高保真Taq酶，如Pfu。第13页/共103页第十四页，共103页。因Taq酶对dATP具有优先(yuxin)聚合活性。5AAPCR扩增产物(chnw)5 由Taq酶扩增的PCR产物(chnw)，3末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A， T载体TT55T7lacZMCS oriAmpr可用T载体克隆。 第14页/共103页第十五页，共103页。 （三）从mRNA合成(hchng)cDNA 以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成(hchng)cDNA第一链，然后在Klenow酶作用下合成(hchng)双链cDNA。第15页

10、/共103页第十六页，共103页。 此法适用于mRNA丰度极高的目的(md)基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。 哺乳动物(brdngw)的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA的90%以上。第16页/共103页第十七页，共103页。 目的mRNA在细胞(xbo)中的含量占细胞(xbo)质总mRNA量的0.5%以下。 目的mRNA在细胞(xbo)中的含量占细胞(xbo)质总mRNA量的50-90%。高丰度mRNA：低 丰 度 ( f n d)mRNA：第17页/共103页第十八页，共103页。步骤(bzhu)：dNTP 逆转录酶primer逆转录酶催化合成cDNA第一链 mRNA cDNA钓

11、取目的基因的mRNA mRNA逆转录酶逆转录酶去除mRNA-cDNA杂交链中的mRNA链 cDNAKlenow酶dNTP Klenow酶合成cDNA第二链 cDNA cDNA第18页/共103页第十九页，共103页。钓取目的(md)基因的mRNA： 与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走。总mRNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱总RNA1）提取特定组织(zzh)或细胞的总RNA，用oligo(dT)纤维素柱分离总mRN

12、A。第19页/共103页第二十页，共103页。2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化(chn hu)特定mRNA。 与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA 探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱总mRNA第20页/共103页第二十一页，共103页。克隆(k ln)平端双链cDNA的方法： 平端直接与载体连接；平端接同聚尾； 加装人工接头(ji tu)(adapter)；加装衔接物(linker)。 第21页/共103页第二十二页，共103页。加装同聚物尾： 利用TdT，在双链cDN

13、A和载体3端加互补的同聚物尾，退火连接成重组(zhn z)分子。 1972年，斯坦福大学P. Labban和P. Kaiser发明(fmng)。 CCCCCCCCCCCCdCTPTdT cDNA53载体53GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4 DNA ligase第22页/共103页第二十三页，共103页。加装人工(rngng)接头(adapter)1978年，康奈尔大学吴瑞发明(fmng)。 adapter是人工合成的一头具有某种限制酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。 GTCG CAGCTTAA53EcoR I ad

14、apter第23页/共103页第二十四页，共103页。注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。 GTCG CAGCTTAA53 AATTCGAC GCTG35 AATTCGAC GCTGGTCGCAGCTTAA 5335T4 DNA ligase 将adapter连接到双链cDNA的两端，直接(zhji)成为人工粘端。 第24页/共103页第二十五页，共103页。CIP去除(q ch)adapter的5-P，使5-P成为5-OH。5 P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P533CIP5OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH533措施(cush)：第25页/共103页第

15、二十六页，共103页。加装衔接(xinji)物(linker): linker是人工合成(rn n h chn)的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段。 EcoR I linker5TGGAATTCCAACCTTAAGGT533第26页/共103页第二十七页，共103页。 将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性(zhn xn)末端。 第27页/共103页第二十八页，共103页。 （四）化学合成法1979年，成功合成E.coli酪氨酸tRNA基因。 -Science1976年，H.G. Khorana提出用化学方法合成 基因的

16、设想；第28页/共103页第二十九页，共103页。已知目的(md)基因的DNA序列。化学合成法的前提(qint)：第29页/共103页第三十页，共103页。小片段粘接法补钉延长(ynchng)法大片段酶促法 战略(zhnl)：化学合成的DNA片断(pindun)一般局限在200bp以内。第30页/共103页第三十一页，共103页。1）小片段(pin dun)粘接法： 分别合成12-15bp的单链DNA小片段。混合退火T4 DNA ligase 片断之间有互补区，混合退火形成有断点的双链，再由T4 DNA ligase连接成完整双链。第31页/共103页第三十二页，共103页。2）补钉(b dn

17、)延长法： 混合退火 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。T4 DNA ligase Klenow 分别合成12-15bp的单链DNA小片段及20-30bp的单链DNA中片段。第32页/共103页第三十三页，共103页。3）大片(d pin)段酶促法： 分别合成40-50bp的单链DNA大片段。混合退火T4 DNA ligase Klenow 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。第33页/共103页第三十四页，共103页。化学合成的份额(fn )较大，成本较高。大片段化学合成的收率(shu l)

18、极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率(shu l)仅7.7%。三种(sn zhn)方法各有利弊：小片段粘接法：大片段酶促法：化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高；化学合成的份额较小，成本较低；第34页/共103页第三十五页，共103页。 化学合成DNA的实质是按照(nzho)序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 第35页/共103页第三十六页，共103页。 DNA合成仪是根据(gnj)固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作

19、过程(guchng)又有液相合成和固相合成两种形式。第36页/共103页第三十七页，共103页。DNA合成(hchng)仪 基因合成一般都是自己设计序列(xli)，交给商业公司合成。第37页/共103页第三十八页，共103页。DNA化学合成的用途(yngt)：合成天然基因修饰(xish)改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探针制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker)第38页/共103页第三十九页，共103页。合成天然(tinrn)基因：有些组织(zzh)特异性mRNA含量很低，很难用cDNA法克隆。 有些(yuxi)基因比较短，化学合成费用较低。 如：生长激素释放

20、抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。第39页/共103页第四十页，共103页。合成(hchng)寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)： 根据已知核酸(h sun)序列，用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。 若未知核酸(h sun)序列，可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸(h sun)序列，但需考虑 密码子的简并性。第40页/共103页第四十一页，共103页。大多数氨基酸拥有(yngyu)简并密码子。某段连续的氨基酸序列: Cys Met Asp Glu Met Lys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAA C T G G

21、 设计系列探针:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG第41页

22、/共103页第四十二页，共103页。 （五）通过构建基因文库分离(fnl)目的基因基因库 (gene pool)基因文库 (gene library or gene bank) 基本概念:第42页/共103页第四十三页，共103页。是特定(tdng)生物体全基因组的集合（天然存在）。基因库 ： 第43页/共103页第四十四页，共103页。 是从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在（人工构建）。基因文库：第44页/共103页第四十五页，共103页。根据(gnj)构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA libr

23、ary) 第45页/共103页第四十六页，共103页。基 因 组 文 库(wnk)： c D N A 文 库(wnk)： 含全部(qunb)基因。含全部蛋白质编码的结构基因。 鸟枪法构建；材料来自染色体DNA；cDNA法构建；材料来自mRNA；第46页/共103页第四十七页，共103页。1、基因组文库(wnk) 将某种生物基因组DNA经超声波或限制酶部分酶切处理后，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部基因的克隆群体。 第47页/共103页第四十八页，共103页。1、基因组DNA的制备(zhbi)： 制备(zhbi)的DNA分子量越大，切割后含不规则末端DNA片段的比率越低，重组率和完备性越高。

24、基因组文库(wnk)的构建 为最大限度保证基因的完整性，基因组DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂。 第48页/共103页第四十九页，共103页。 常规方法制备的染色体DNA长度一般100kb，如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡(jnpo)，可获得1,000kb的DNA片段。第49页/共103页第五十页，共103页。 一般采用(ciyng)超声波和限制酶部分酶切法。保证DNA片段(pin dun)大小均一。2、基因组DNA的切割(qig)：目的：保证DNA片段之间存在部分重叠区；第50页/共103页第五十一页，共103页。超声波处理(chl)：

25、 处理后的DNA片段呈平末端，需加装人工(rngng)接头。第51页/共103页第五十二页，共103页。产生粘性(zhn xn)末端，可与常用克隆位点（如BamH I、Bgl II）连接。部分(b fen)酶切法： 部分酶切片(qi pin)段大小可控，可得到15-45kb的随机片断；选用4bp识别序列的限制酶，如Sau3A。第52页/共103页第五十三页，共103页。3、载体(zit)和受体的选择构建大型基因组文库（动植物和人类(rnli)），选择BAC或YAC。根据载体(zit)，选择E.coli、Yeast。常选-DNA或Cosmid；受体：载体：第53页/共103页第五十四页，共103

26、页。第54页/共103页第五十五页，共103页。第55页/共103页第五十六页，共103页。在基因组文库构建(u jin)中，最应引起重视的问题：尽量(jnling)提高载体与外源DNA片段的连接效率！根据载体(zit)的装载量，将DNA片段分级分离；利用CIP，去除载体的5-P； 利用TdT，在DNA片段的3-OH加同聚尾。 措施： 第56页/共103页第五十七页，共103页。基因文库的完备(wnbi)性： 是指在构建的基因(jyn)文库中任一基因(jyn)存在的概率P，与基因(jyn)文库最低所含克隆数N的关系：N = ln(1P) / ln(1f)P= 基因文库的完备(wnbi)性（某一

27、基因被克隆的概率）f = 克隆片段平均大小 / 生物基因组大小 第57页/共103页第五十八页，共103页。N = ln(1P) / ln(1f)如：人单倍体DNA长2.9106kb，克隆片段平均大小(dxio)15kb，构建完备性0.9的基因文库，至少需45万个克隆；当完备性提高至0.9999时，至少需180万个克隆。即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组(zhn z)克隆的基因文库，这时克隆片段总和为整个基因组的 倍。9.3第58页/共103页第五十九页，共103页。即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克

28、隆的基因文库，若1个基因文库的插入片段(pin dun)总和为整个基因组的10倍以上，就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。 第59页/共103页第六十页，共103页。基因文库的质量标准：除尽可能高的完备(wnbi)性外，理想的基因文库还应具备：重组克隆能稳定(wndng)保存、扩增、筛选。克隆总数不宜(by)过大，以减轻筛选工作的压力；载体的装载量必须大于基因的长度；含有相邻DNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；第60页/共103页第六十一页，共103页。保存文库(wnk)于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中第61页/共1

29、03页第六十二页，共103页。第62页/共103页第六十三页，共103页。2）保存(bocn)文库于液体培养基中 从平板上挑取全部克隆(k ln)，接种于含适当抗生素的液体培养基中，混合的细菌生长数代后，加入终浓度25%的甘油，-70保存。缺点：由于文库菌落生长的不均匀性，可能(knng)导致文库中某些特定序列过多或过少。第63页/共103页第六十四页，共103页。3）保存单个克隆(k ln)子于液体培养基中 从平板上挑选单个克隆，接种于含适当抗生素的液体(yt)培养基中，菌体生长至一定浓度时，加入终浓度25%的甘油，-70保存。缺点(qudin)：需保存的克隆子数过多，工作量大。第64页/共

30、103页第六十五页，共103页。从基因组文库中筛选(shixun)目的基因 大型基因组文库由数十万甚至(shnzh)上百万个重组克隆组成，除一些具特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因）可用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选）直接筛选外，一般均需多轮操作步骤。第65页/共103页第六十六页，共103页。密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板目的重组克隆铺板根据目的基因已知核苷酸序列进行(jnxng)筛选第66页/共103页第六十七页，共103页。通过构建基因组文库获取目的(md)基因的问题： 该方法仅适用于原核基因(jyn)的分离，较少采用。不能除去真核生物目的(md)基因的内含子结构。工作量大，

31、需了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；第67页/共103页第六十八页，共103页。“鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹(sn dn)法” 用限制酶部分酶切染色体DNA将酶切片段克隆入载体转化受体细胞并扩增分离带有目的基因的DNA片段筛选目的重组子第68页/共103页第六十九页，共103页。用“鸟枪法”获取目的(md)基因：缺点(qudin)：操作(cozu)简便。工作量大；具有一定的盲目性。 优点：第69页/共103页第七十页，共103页。优点(yudin)：保证目的基因的完整性，提高目的重组子 的出现频率，简化操作。 鸟枪法操作的改进： -使用(shyng)特定限制酶完全

32、酶切染色体DNA。前提：已知目的基因(jyn)的酶切图谱。策略：用目的基因两端的限制酶完全酶切染色体 DNA，然后与载体拼接。第70页/共103页第七十一页，共103页。2.0 kb1.6 kb1.8 kb如： 已 知 目 的 基 因 位 于1.8kb的Sal I片段中，将染色体DNA用Sal I切开，琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.6-2.0kb区域内的凝胶块，从此凝胶中回收DNA片段，与载体(zit)连接。第71页/共103页第七十二页，共103页。基因组文库重组克隆(k ln)的排序 构建大型基因组文库技术上并不困难，若文 库 插 入 片 段 总 和 为 基 因 组 的 1 0 倍 以 上(

33、yshng)，就能从其中调出任何一段DNA序列。 然而(rn r)基因文库的克隆是随机序列，必须将所有克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。 -这项工作的工作量远大于文库构建。第72页/共103页第七十三页，共103页。酶切片段末端标记法随机(su j)探针联合杂交法染色体走读法基因组文库重组克隆的排序(pi x)方法：第73页/共103页第七十四页，共103页。酶切片(qi pin)段末端标记法：1、将单一YAC克隆插入DNA片段(pin dun)用限制酶均匀地水解成若干片段(pin dun)，末端标记同位素。 HHHH载体(zit)DNA克隆DNA第74页/共103页第七十

34、五页，共103页。2、然后用Sau3A将末端标记的DNA片段降解成碎片，PAGE电泳，每10个YAC克隆走在一块板上，形成(xngchng)10个克隆的特征性DNA指纹图谱。 SSSSSSS SSS SSSSSSS SS10克隆指纹图谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10第75页/共103页第七十六页，共103页。3、电脑分析指纹(zhwn)图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹(zhwn)图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。10克隆指纹(zhwn)图谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10第76页/共103页第七十七页，共103页。随机(su j)探针

35、联合杂交法：1、将若干(rugn)YAC克隆固定在薄膜上，复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针（序列随机）。 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1011121314151617181920A B C D E FG第77页/共103页第七十八页，共103页。2、用20种探针(tn zhn)随机定位杂交（1对1）20份YAC克隆薄膜。若某2个克隆同时对同一种探针(tn zhn)呈现杂交阳性反应，则这2个克隆有可能相互重叠。 01 02 03 04 05 06 070809 1011121314151617181920A B C D E FG20个随机(su j)探针第78

36、页/共103页第七十九页，共103页。3、若将杂交阳性(yngxng)结果记为“1”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。 01020304050607 08091011121314 1516 17 1819 20DABCEFG111111111111111111111111111111第79页/共103页第八十页，共103页。01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB第80页/共103页第八十一页，共103页。1

37、、从基因文库中任取1个克隆作为染色体走读(zud)的起点，将其两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0kb范围内。 染色体走读法(d f)(chromosome walking)：走读的起点(qdin)克隆片段亚克隆旁测序列第81页/共103页第八十二页，共103页。2、以亚克隆(k ln)DNA片段为探针，与基因文库杂交，阳性克隆(k ln)中的插入DNA片段必定与起点克隆(k ln)所含的DNA片段连锁在一起。 走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列 探针标记第一轮杂交阳性克隆阳性克隆第82页/共103页第八十三页，共103页。3、再以阳性克隆片段的两端序列为探针(tn zhn)，进行第二

38、步走读，直至线型染色体DNA的端点。 阳性(yngxng)克隆阳性(yngxng)克隆第二轮杂交第二轮杂交第83页/共103页第八十四页，共103页。走读的起点克隆片段第84页/共103页第八十五页，共103页。 将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA，与载体连接，转化(zhunhu)宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群体。 2、cDNA文库(wnk)第85页/共103页第八十六页，共103页。信息量远小于基因组文库，容易(rngy)构建；具有(jyu)时空性和组织细胞特异性。cDNA文库(wnk)的特点：不含内含子序列；可以在细菌中直接表达；包含该生物全部蛋白质编码的结构基

39、因；第86页/共103页第八十七页，共103页。 在高度分化的生物体中，不同组织(zzh)或细胞在相同时段、相同环境背景下，mRNA种类、表达水平也不同。 同一组织或细胞在不同(b tn)时段、不同(b tn)环境背景下，mRNA种类、表达水平不同(b tn)。具有(jyu)时空性和组织细胞特异性：第87页/共103页第八十八页，共103页。 cDNA文库特异(ty)地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此具有时空性和组织细胞特异(ty)性。第88页/共103页第八十九页，共103页。cDNA文库(wnk)的构建总RNA提取(tq)mRNA的分离纯化cDNA第一链的合

40、成cDNA第二链的合成第89页/共103页第九十页，共103页。1 ） 总 R N A 提 取(tq)： 商业化试剂盒。第90页/共103页第九十一页，共103页。 利用(lyng)mRNA含polyA尾，将其从总RNA中分离纯化，mRNA只占总RNA的1-2%。2）mRNA的分离(fnl)纯化： 商业化oligo(dT)纤维素柱。 哺乳动物(brdngw)mRNA长度为0.5-8.0kb，大部分为1.5-2.0kb。第91页/共103页第九十二页，共103页。第92页/共103页第九十三页，共103页。3）cDNA第一(dy)链的合成：cDNA第一(dy)链mRNAAAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTTTT 5AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTT