羊肚菌菌核发育形态、IMV检测及原生质体融合技术研究

1、羊肚菌菌核发育形态、 IMV 检测及原生质体融合技术研究 羊肚菌在生物分类上属于子囊菌门 ,为世界著名的食药兼用用菌 , 风味独特 , 并具有抗氧化、消炎、抗菌、免疫刺激和抗肿瘤等多种生物活性。2012年以来 ,羊肚菌大田栽培首次在我国四川成功实施 , 并快速向全国辐射。然而,与羊肚菌人工栽培快速发展形势不相称的是 , 羊肚菌的基础理论研究 还比较落后 , 限制了羊肚菌产业的持续健康和稳定发展。 譬如,羊肚菌菌核发育机 制、菌种质量评价、育种新技术应用等研究 , 将促进羊肚菌生产的健康发展。本研究采用电子显微术和激光共聚焦显微术研究了羊肚菌菌核发育过程中 的形态和生理变化 ,发现羊肚菌菌核发育

2、涉及了自噬、 凋亡和坏死等事件 , 羊肚菌 菌核的能量储存物质为脂肪 ; 建立了羊肚菌栽培菌株身份( identity )、交配型(mating type )和活力(vitality )的IMV检测技术,可用于羊肚菌人工栽培菌 株在大生产中的适应性检验 ; 优化了羊肚菌原生质体释放和再生技术 , 建立了梯 棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活融合技术 , 获得了一批融合菌株 , 对推动羊肚 菌原生质体融合育种技术发展具有现实意义。 主要研究结果如下 : ( 1)对梯棱羊 肚菌 1号菌株,菌丝重复分枝和末端菌丝或亚末端菌丝分枝的扩大形成菌核原基 其菌核发育兼具末端型和侧生型特性 , 为复合型 ; 透射

3、电子显微术研究发现羊肚 菌菌核发育涉及了自噬、凋亡和坏死事件 ; 活细胞共聚焦激光成像研究揭示了菌 核中的能量储存物质为脂质性质。脂肪的定性测定表明 ,菌核中积累的脂肪多于营养菌丝细胞。 (2)分别采用ITS-1/ITS-4、RPB1B-F/RPB1B-RRPB2B-F/RPB2B-引物对实验室保存的 6 种羊 肚菌的基因组DNA进行PCRT增,测定了其ITS、RPB1BRPB2BS因序列,并进行 了序列比对分析结果表明,菌株4号和XuChang为梯棱羊肚菌(Morchella importuna ),菌 株 201、13 号、SZL-3 号为六妹羊肚菌(Morchella sextelata

4、 ),菌株 CuBing与 Morchella kaibabensis 同源相似性为 98.9%,可信度为 100%。设计和筛选了 羊肚菌交配型基因测定的特异性引物 , 发现引物对 Mat1-1/Mat1-1-1 可特异性鉴 定六妹羊肚菌的交配型 , 引物对 Mat1-1-1/Mat1-2-1 能够鉴定梯棱羊肚菌的交配 型。采用筛选的引物对分别对测定的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的基因组DNA进行PCFT增,发现每对引物均能扩增出1条清晰的条带,并且混合引物均能 扩增出两个条带。这些结果表明 ,筛选的引物对可用于六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌 菌株的交配型分析 ,测试的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株均未发生

5、交配型缺失 , 六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌均属于典型的异宗结合真菌。测定了六个羊肚菌菌株的脂质过氧化水平 ,评价菌株的衰老情况。 结果发现, 菌株SZL-3和CuBing老化程度最高,菌株201、13号活力最强,菌株4号、XuChang 老化程度介于二者之间。(3)对梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生质体释放条件进行了优化。 结果表明, 梯棱羊肚菌原生质体制备的最优条件为 :稳渗剂为 0.6 M 甘露醇,酶液体系为 2% 溶壁酶+ 1 %蜗牛酶+ 1 %纤维素酶,菌龄为3 d。在该优化条件下,梯棱羊肚菌原生质体产量为1 x 10⁶个/mL,原 生质体再生率可达

6、 1.8%。六妹羊肚菌原生质体制备最佳条件为 :稳渗剂为 0.6 M 甘露醇,酶液体系为 2%溶壁酶+1 %蜗牛酶+1 %纤维素酶,菌龄为 3 d。在该优化条件下,六妹羊肚菌原生质体产量为6.5 x 10⁵个/mL,原生质体再生率可达 1.5%。(4)优化了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活原生质体融合条件结果表明,2 种羊肚菌种间原生质体融合的最优条件为 : 原生质体融合温度25C,溶液 pH 8.0,CaCI₂ 终浓度 50 mmol/L,融合剂 PEG浓度 25% 在优化条件下 , 原生质体融合率可

7、达 0.8%。（5）筛选了鉴定 2 种羊肚菌的特异性 RAP（Drandom amplified polymorphism DNA随机扩增多态性DNA分子标记。测定了 2亲本及融合子的RAP标记,通过 聚类分析发现双亲本与融合子可分为 3 大类群:第一类群包括亲本梯棱羊肚菌 （P1）, 第二类群包括所有融合子 , 第三类群包括亲本六妹羊肚菌（ P2）。16 个融合子可以分为 3组, 其中 1、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、 16为一组,4 、7为一组, 2 、3为一组。这些结果表明 ,采用梯棱羊肚菌和六妹羊 肚菌种间双灭活融合技术获得的羊肚菌原生质体融合子为真正的融合子。

8、（6）分别选取融合子1号（R1）、融合子2号（R2）、融合子4号（R4）、和 双亲本进行培养 , 比较每种融合子和双亲本菌株的菌落形态差异 , 发现梯棱羊肚 菌（P1）、六妹羊肚菌（P2）、R1、R2、R4均产菌核且产量多，菌核形态均为点状； 按照菌丝生长速度 ,各菌株的排列顺序为 :R4>P1>P2>R2>R1, 但5菌 株生长速度相差不大；不同菌株的菌块恢复时间不同，其中P2恢复时间最长,P1 恢复时间最短,1号、2号和4号融合子介于二者之间；P1、R1、R2、R4的菌丝紧 密、P2稀疏;所有菌株菌落边缘均整齐。这些结果表明,2种羊肚菌的融合子为真 正的融合菌株。（7）人工栽培发现，融合子R1和R4子囊果形态上接近2号亲本（P2,为六 妹羊肚菌）,R5和R8形态接近于1号亲本（P1,为梯棱羊肚菌），而R2和R3介 于两亲本之间。（8）人工栽培表明 ,2 亲本与 6个融合子 8个菌株产量之间均差 异显著,没有任何融