综合测定方法

1、实验 1 植物体内硝态氮含量的测定植物体内硝态氮含量可以反映土壤氮素供应情况， 常作为施肥指标。 另外，蔬菜类作物特别是叶菜和根菜中常含有大量硝酸盐，在烹调和腌制过程中可转化为亚硝酸盐而危害健康。因此，硝酸盐含量又成为蔬菜及其加工品的重要品质指标。 测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养状况，而且对鉴定蔬菜及其加工品质也有重要的意义。传统的硝酸盐测定方法是采用适当的还原剂先将硝酸盐还原为亚硝酸盐， 再用对氨基苯磺酸与 - 萘胺法测定亚硝酸盐含量。此法由于影响还原的条件不易掌握，难以得出稳定的结果，而水杨酸法则十分稳定可靠，是测定硝酸盐含量的理想选择。一、原理在浓酸条件下，NO3

2、 与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。其反应式如下：OHOHH2SO4COOH + OHCOOH + NO 3NO 2生成的硝基水杨酸在碱性条件下（pH>12）呈黄色，最大吸收峰的波长为410nm，在一定范围内，其颜色的深浅与含量成正比，可直接比色测定。二、仪器与用具分光光度计； 天平（感量 0.1mg）；20ml 刻度试管； 刻度吸量管0.1ml、0.5ml 、5ml 、10ml各 1 支； 50ml 容量瓶；小漏斗（5cm） 3 个；玻棒；洗耳球；电炉；铝锅；玻璃泡；7cm定量滤纸若干。三、试剂(1)500mg/L 硝态氮标准溶液： 精确称取烘至恒重的 KNO 3 0.7221g 溶于蒸馏

3、水中， 定容至 200ml 。(2)5%水杨酸硫酸溶液：称取5g 水杨酸溶于100ml 比重为 1.84 的浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效。称取 15g 水杨酸溶于300ml 比重为 1.84 的浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效(3)8%氢氧化钠溶液：80g 氢氧化钠溶于1L 蒸馏水中即可。160g 氢氧化钠溶于2L 蒸馏水中即可。四、方法1标准曲线的制作（ 1）吸取500mg/L硝态氮标准溶液1ml 、 2ml 、 3ml 、 4ml 、 6ml 、 8ml 、 10ml、 12ml分别放入50ml 容量瓶中，用无离子水定容至刻度，使之成10、2

4、0、30、 40、60、80、100、120mg/L 的系列标准溶液。（ 2）吸取上述系列标准溶液0.1ml ，分别放入刻度试管中，以0.1ml 蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4ml 5% 水杨酸硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min 后，再加入 8% NaOH 溶液 9.5ml ，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10ml。1（ 3）绘制标准曲线： 以空白作参比，在 410 nm 波长下测定光密度。以硝态氮浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。2样品中硝酸盐的测定（ 1）样品液的制备取一定量的植物材料剪碎混匀，用天平精确称取材料2g 左右， 重复三次，分别放入三支

5、刻度试管中，各加入10ml 无离子水，用玻璃泡封口，置入沸水浴中提取 30min 。到时间后取出，用自来水冷却，将提取液过滤到25ml 容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。（ 2）样品液的测定吸取样品液0.1ml 分别于三支刻度试管中，然后加入5%水杨酸硫酸溶液0.4ml ，混匀后置室温下20min ，再慢慢加入9.5ml 8%NaOH 溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在 410nm 波长下测其光密度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出硝态氮浓度，再用以下公式计算其含量。C VNO3N 含量 = W式中C标准曲线上查得或回归方程计算得NO 3 N 浓度；V 提取样品液总量；W 样品鲜

6、重。实验 2硝酸还原酶活性测定硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理与方法。一、原理硝酸还原酶能将 NO3还原成 NO 2产生的 NO 2 的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的NO2含量，即可确定酶活性大小。NO 2 含量可用磺胺显色法测定。 NO2与磺胺及 a萘胺在酸性条件下生成红色偶氮化合物 其反应如下：酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来表示：亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1 小

7、时。二、实验材料、仪器和试剂1实验材料植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片2仪器（ 1）分光光度计（ 2）离心机（ 3）真空泵和真空干燥器（ 4）恒温水浴锅（ 5）恒温箱（ 6）刻度吸管（ lml 、 2ml、 5ml ）（ 7）试管（ 8）天平（9）三角瓶（ 50ml）3试剂（ 1） 亚硝酸钠标准液：称取 0.1000g 亚硝酸钠（ AR），用蒸馏水溶解并定容至 100ml。然后吸取 5ml 再用蒸馏水定客至 1000m1。即为浓度 5g ml 的亚硝酸钠标准液。(2)0.1mol/lpH7.5磷酸冲液230.0905gNa2HPO4·12H2O+2.4965gNaH2PO4&#

8、183;2H2O，加蒸馏水（或者去离子水）定容到 1000ml （总共 1500ML(先配 1000Ml 再配 500ml,(15.0453g Na2HPO4· 12H2O,1.2483 NaH2PO4·2H2O，加蒸馏水（或者去离子水）定容到500ml) 。（ 3） 3mol/L HCl：125ml 浓盐酸加蒸馏水定容到 500ml 。 375Ml 浓盐酸加蒸馏水定容到 1500ml（ 4） 1磺胺溶液： 5.0g 磺胺溶于500ml3mol/LHCl 中。总共 1500ml (1000ml+500ml)15.0 磺胺溶于1500ml 3mol/LHCl 中（ 5） 0.

9、2 a- 萘胺溶液： 1.0ga- 萘胺溶于125ml 冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。0.2 a- 萘胺溶液：2.0g a-萘胺溶于250ml 冰醋酸后用蒸馏水定容到1000ml, 贮于棕色瓶中 。（ 6） 30%三氯乙酸溶液：30g 三氯乙酸。水溶后定容至100ml。150g 三氯乙酸 .水溶后定容至500ml.（ 7）KNO3溶于 1000ml 蒸馏水中 +11.11 gKNO3溶于 500ml 蒸馏水中 .四、操作步骤1标准曲线的制作取 6 支试管，编号，按下表操作管号操作项目123456NaNO 2 淀标准液 (ml)00.40.81.21.62.0蒸馏水 (ml)2

10、.01.61.20.80.40NaNO2 含量（ g）0246810磺胺 (ml)各 4 萘胺各 4摇匀在 30水浴中保温20 分钟。然后在520ml 波长下比色测定消光值。以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。2酶反应和酶活性测定0.5cm2h 的小片，混匀后称三份，每份将白萝卜叶片洗静，剪成0.5 1.0g，分另放人50ml 的三角瓶中，编号按下表加试剂摇匀，置真空于燥器中，抽气10 分钟。然后将三角瓶放人恒温箱，在30暗条件下保温 30 分钟。取出后向 2，3 号瓶中分别加人 l ml 30 三氯乙酸终止反应，将反应液离心（ 3000rmp 10 分钟）或过滤。分另吸取 2

11、ml 反应液于三只试管中各加 4ml 1磺胺和 0.2a萘胺。3摇匀在 30水浴中保温20 分钟。然后在520ml 波长下比色测定消光值。五、结果与计算酶活性（亚硝酸钠g g 鲜重· h）亚硝酸钠微克数（ g）×稀释倍数样品重（ g）×时间（ h）六、注意事项1酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸还原酶把NO2 还原成 NH 3。2田间采样应在早晨9 点以后，光合作用进行了一段时间再进行。实验三植物体内 GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定方法一一、原理2+谷氨酰胺合成酶（ GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和 Mg 存在下

12、，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的 谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位 1 1 mol · mg protein · h。也可间接用 540nm处吸1 1光值的大小来表示，单位 A· mgprotein · h。二、 仪器与用具冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、 1ml ）。三、试剂先配制 0.05Mol/l的盐酸溶液：加入4.15ml浓盐

13、酸，定溶到 1000ml, 再配制 0.1mol/l的盐酸溶液： 8.3ml 浓盐酸，定溶到1000ml.提取缓冲液：2+（ 1）0.05mol/LTris-HCl ， pH8.0，内含蔗糖。2mmol/L Mg ， 2mmol/L DTT ， 0.4mol/L称取 Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ， 0.1245g MgSO4· 7H2O，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和 34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05mol/L HCl 调至 pH8.0 ，最后定容至250ml；重新配制 500ml：0.05mol/L Tris-HCl2+，pH8.0 ，内含

14、 2mmol/L Mg ，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取 Tris:3.0590g,，0.2490MgSO4.7H2O，0.3086gDTT( 二硫苏糖醇 ) 和 68.50g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至 pH8.0 ，最后定容至 500ml。注意： 0.05mol/l HCl的用量。 pH用什么 ,pH 试纸。（ 2）反应混合液A（ 0.1mol/L Tris-HCl缓冲， pH7.4 ）：2+谷氨酸钠盐， 20mmol/L 半胱氨酸和 2mmol/L EGTA，称取内含 80mmol/L Mg ，20mmol/L3.0590g Tris ，4

15、.9795gMgSO·7H O, 0.8628g 谷氨酸钠盐， 0.6057g 半胱氨酸， 0.1920gEGTA，42去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至 pH7.4 ，定容至 250ml；（ 3）反应混合液B（含盐酸羟胺， pH7.4 ）：反应混合液 A 的成分再加入 80mol/L盐酸羟胺， pH7.4；（加入盐酸羟胺1389.8g., 盐酸羟胺有巨毒）（ 4）显色剂（ 0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3 和 0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA （三氯乙酸）， 10.1021g FeCl· 6H O，去离子水溶解

16、后，加5ml 浓盐酸，32定容至 100ml；6.6352 三氯乙酸，去离子水溶解后，加10Ml 浓盐酸，定容至 200ml.（ 5） 40mmol/L ATP 溶液： 0.1210g ATP 溶于 5ml 去离子水中（临用前配制） 。 40mmol/LATP 溶液： 2.4200ATP 溶于 100ml 去离子水中（临用前配制）四、方法41.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4下 15,000g 离心 20min ，上清液即为粗酶液。2.反应1.6ml 反应混合液B ，加入 0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37

17、下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心 10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取 2ml 用考马斯亮蓝 G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。4.原始数据记载5.结果计算：AGS 活力 (A · mg1protein · h1) PVt式中A 540nm 处的吸光值；P粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）；V 反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）；T 反应时间（ h）。方法二：一、原理ATP 和 Mg 2

18、+存在下，它催谷氨酰胺合成酶（ GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。 谷氨酰胺合成酶活性可用产生的谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位 mol ·mg1 1处吸光值的大小来表示，单位 A ·mgprotein ·h 。也可间接用 540nm 1 1。protein ·h二、仪器：冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、 1m三、药品：提取液：

19、0.1mol/lTris-HCL,pH7.6,1.0mmol/LEDTA,1.0mmol/LMgCl 2.2O,6H10mmol/L2- 硫基乙醇：加 6.1180gTris, pH7.6,0.1920gEDTA,0.1245MgSO4.7H2O,0.3907g2-硫基乙醇 ,去离子水溶解后，用 0.05 mol/L HCl 调至pH7.6，最后定容至 500ml.四、方法1.粗酶液提取6 谷氨酸合酶活力测定改良茚三酮法定量的谷氨酸合酶活力测定技术基本原理不同氨基酸在同一pH 下所带的净电荷的种类和数量不同。一pH6-7 范围内 ,谷氨酞胺所带的净电荷为零,而谷氨酸带负电荷(pH7.0 时最大

20、为 -1.00). 当含反应底物谷氨酞胺和产物谷氨酸的酶反应液在中性条件下通过醋酸型阴离子交换树脂柱时,谷氨酞胺不带电荷,不能被树脂吸附 ,用蒸馏水即可将它从柱子上洗脱下来,而谷氨酸带负电荷与树脂上吸附的醋酸根离子相互置换而被吸附在柱子上,当用高浓度的醋酸洗脱时它又被醋酸根离子置换下来。这样就将产物谷氨酸与反应物谷氨酞胺分离开来。再用改良茚三酮法测定谷氨酸量后,就可得到以产生的谷氨酸量表示的谷氨酸合酶.仪器：离子交换树脂提取缓冲液林振武11的方法，酶提取液 : 100 mmol L 1 磷酸钠缓冲液( pH 7. 5 ) ，内含100 mmol5L 1KCl5 mmol L 1EDTA0. 1

21、% ( v /v) 巯基乙醇 0.1% ( v /v )曲拉通X 100 ， 0. 5 mmol L 1PMSF (苯甲基磺酰氟，现用现加) 。酶反应液 (1)50mmol L 1L 谷氨酰胺 (2)50 mmol L 1酮戊二酸（ 3） 0. 25 mmolL 1NADH (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 、（ 4）20 mmol L 1Na2 S2 O4 (溶于 20 mmol L 1NaHCO3 )。各试剂均用 50 mmol L 1 磷酸钠缓冲液 ( pH 7. 5) 配制 。茚三酮试剂，总体积： 110ml,0.55g 茚三酮， 1.24g CdCl2.2H2O,80ml 90% 乙醇， 1

22、00ml 冰醋酸， 20ml蒸馏水。这样配制的茚三酮试剂在空气中稳定 ,在冰箱中可以保存一个月。酶的提取：称取植物材料1g 于研钵中，加 3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中， 4下 15,000g离心 20min ，上清液即为粗酶液，(根据谷氨酰胺合成酶 )酶活力测定：操作步骤反应液各取（1）（ 2）（ 3）各取置 30水浴预保温分钟 , 再加 0.2ml 粗酶液 ,最后加 0.2ml预保温过的反应液(4) 起始反应 , 反应混合液总体积1 毫升 , 以不加铁氧还蛋白加( 0.2ml50mmol/l 磷酸缓冲液代替 )为对照 . 混合液于30保温 10 分钟后，于沸水浴加热1.5 分钟 ,再剧烈摇动几分钟以终止反应,待待冷后用0.5mol/lHCl将 pH调至 7.0然后4000rmp 离心10分钟,上清液及2ml 洗离心管的水全部上离子交换柱, 等样品全部进入柱后用 5ml 水 ,0.5ml 醋酸依次洗柱子,洗脱液丢弃， 最后用醋酸洗脱吸附在柱子上的谷氨酸 ,收集全部洗脱液 . 直接加 3ml茚三酮试剂，混匀后于 80水浴保温分钟后立即取出，用冰水迅速冷却,测 506nm 处的消光系数 ,对照工作曲线求出产生的谷氨酸的量.工作曲线