细胞基质金属蛋白酶2MMP2活性免疫捕获定量检测试剂盒

1、细胞基质金属蛋白酶2（ MMP-2 ）活性免疫捕获定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞基质金属蛋白酶2（ MMP-2）活性免疫捕获定量检测试剂是一种旨在通过使用MMP-2特异性抗体捕获样品中的MMP-2抗原蛋白，识别并切离人工合成含硫多肽，释放出巯基，进而使用Ellman试剂，产生黄色 5-巯基 -2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）样品中基质金属蛋白酶2 的特异活性定量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。技术背景基质金属蛋白酶（Matrix

2、 metalloproteinases ；MMPs ）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的 MMPs 至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（ extracellular matrix ）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs 分为 4大类：（ 1）胶原酶： MMP1 、MMP8 、 MMP13 主要消化、型胶原和蛋白多糖；（2）明胶

3、酶（型胶原酶） ：MMP2 、MMP9 ，又称明胶酶 A 、 B ，主要消化、 、型胶原和弹性纤维； （3）基质溶解素： MMP3 、MMP7 、MMP16 、MMP11 、MMP12 ，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、胶原及MMP1 、MMP8 、MMP9 ；（4）膜型金属蛋白酶：MT 1-MMP 、 MT 2-MMP 、MT 3-MMP ，主要作用于明胶、型胶原、 MMP2 。体内绝大多数细胞并不储备MMPs ，当需要 MMPs 的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs 以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外， 随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，

4、一种激活的 MMPs可激活另一种 MMPs ，形成瀑布效应。 基质金属蛋白酶-2 ，又称明胶酶 A （ gelatinase-A）或 IV 型胶原酶（typeIV collagenase），其前体分子量为XX ，激活后分子量为XX 和 XX 。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克 /毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin ）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5（laminin-5 ）、前体肿瘤坏死因子-（pro-TNF- ）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉

5、粥样硬化等疾病有关。基质金属蛋白酶2的活性检测通过使用MMP-2 特异性抗体涂板在孔板里的相应孔里，然后捕获样品中的MMP-2 抗原蛋白，在胶原酶潜酶活化剂醋酸氨基苯汞（ 4-aminophenylmercuric acetate ；APMA ）的存在下，识别并切离人工合成含硫多肽 （thiopeptide ）底物 Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl ）-LG-OC 2H 5，释放出巯基 （sulfhydrylgroup），进而与 Ellman 试剂 5,5-二硫基 -双（ 2-硝基苯甲酸） 5,5 -dithiobis- （2-nitrobenzoic

6、acid ）；DTNB 反应后，产生黄色的 5-巯基 -2-硝基苯甲酸 （5-thio-2-nitrobenzoic acid ；TNB ），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量测定组织基质金属蛋白酶2的特异活性。其反应系统为：产品内容清理液（Reagent A）XX 毫升裂解液（Reagent B）XX 毫升抗体液（缓冲液（封阻液（激活液（反应液（标准液（稀释液（Reagent C）Reagent D）Reagent E）Reagent F）Reagent G）Reagent H）Reagent I）XX 毫升XX 毫升XX 毫升XX 毫升XX 毫升XX 微升XX 毫升产品说明书1

7、 份保存方式保存标准液（ Reagent H）在-70 冰箱里；保存抗体液（ Reagent C） 激活液（Reagent F）和 反应液（ReagentG）在 -20冰箱里，其余的保存在4冰箱里；有效保证3 月用户自备1.5 毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞（微型）台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育酶标板：用于反应分析的容器酶标仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将20冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1准备好 25cm2 细胞培养瓶或60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至

8、5 X 10 6 细胞）2小心加入 XX 毫升清理液（ Reagent A），覆盖生长表面3小心抽去清理液4使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化 ）5加入 XX 毫升清理液（ Reagent A），混匀细胞6移入到预冷的15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始 ）7放进 4台式离心机离心5 分钟，速度为300g8小心抽去上清液9加入 XX 微升裂解液（ Reagent B），充分混匀10 转移到预冷的1.5 毫升离心管11强力涡旋震荡15 秒12 置于冰槽里孵育30 分钟13 放进 4微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或 13000RPM ，例如 eppe

9、ndorf 5415）14 小心移取 500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管15 移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒MB30030.1 ）16 使用稀释液（ Reagent I）调节蛋白浓度为XX 毫克 / 毫升17 即刻放进 70保存或置于冰槽里继续后续操作二、 测定准备1 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等），置于冰槽里2 设定好酶标仪（温度为37）：波长 412nm三、 标准样品配制1 准备好 5个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管2 分别加入XX 微升 稀释液（ Reagent I）到 1 至 5 号管3 移取

10、 XX微升 标准液（ Reagent H）到 1 号管，混匀4 小心移取XX 微升 1 号管稀释的标准液（ Reagent H ）到 2 号管，混匀5 小心移取XX 微升 2 号管稀释的标准液（ Reagent H ）到 3 号管，混匀6 小心移取XX 微升 3 号管稀释的标准液（ Reagent H ）到 4 号管，混匀7 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号稀释液（ Reagent I）标准液（ Reagent H）标准 MMP-2 浓度1XX 微升XX 微升XX 纳克 /毫升2XX 微升XX 微升1号管XX 纳克 /毫升3XX 微升XX 微升2号管XX 纳克 /毫升4XX 微

11、升XX 微升3号管XX 纳克 /毫升5XX 微升00四、样品测定1 在酶标板上做好相应标记：标准样品、样品活性2 分别移取 XX 微升抗体液（ Reagent C）到酶标板的相应孔里3 放进 4冰箱里孵育16 小时（或室温下孵育2 小时）4 小心抽去抗体液（ Reagent C），确保无液体残留5 分别加入 XX 微升缓冲液（ Reagent D）6 小心抽去缓冲液（ Reagent D），确保无液体残留7 重复实验步骤5 至 6 一次8 分别加入 XX 微升封阻液（ Reagent E）9 室温下孵育60 分钟10小心抽去封阻液（ Reagent E），确保无液体残留11分别加入XX 微升缓

12、冲液（ Reagent D）12小心抽去缓冲液（ Reagent D），确保无液体残留13重复实验步11 至 12 一次14分别加入XX 微升上述配制的标准液 和待测样品（ 100 微克蛋白总量）到相应孔里15放进 37培养箱里孵育60 分钟16小心抽去标准液 和待测样品，确保无液体残留17分别加入XX 微升缓冲液（ Reagent D）18小心抽去缓冲液（ Reagent D），确保无液体残留19重复实验步17至 18三次20分别加入XX 微升激活液（Reagent F）21放进37培养箱里孵育120 分钟22小心抽去激活液（Reagent F），确保无液体残留23分别加入XX 微升反应液（

13、Reagent G）24放进37培养箱里孵育60 分钟（注意：如果活性过低，可以延长孵育时间至6 小时）25即刻放进酶标仪（412nm 波长）检测，获得吸光读数26构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光读数OD ；横座标（27根据标准曲线获得样品对应MMP2 浓度（纳克 / 毫升）X 轴）为标准MMP2浓度（纳克/毫升）五、计算样品活性单位XX注意事项1 本产品为 25 次操作，包括标准液2 本产品的检测敏感度为 1 纳克 /毫升3 操作时，须戴手套4 系统操作过程中，标准液测定只需1 次5 样品准备要点如下：a) 样品中避免使用 EDTA 、 EGTA 等二价阳离子鳌和剂b)样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）c)如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂 （建议使用胶原酶潜酶活化剂 （ APMA MB12197 ）6 待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为100 微克 /100 微升（本公司提供Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒MB30030