WesternBlotting技术实用教案

1、实验实验(shyn)目的目的 检测一个检测一个(y (y )基因的表达产物是否正确基因的表达产物是否正确 - - 定性定性 比较表达产物量的相对变化比较表达产物量的相对变化 - - 半定量半定量第1页/共32页第一页，共33页。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原(kngyun)，与对应的

2、抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 基本原理基本原理第2页/共32页第二页，共33页。基本基本(jbn)流程流程l转膜l封闭l一抗杂交(zjio)l二抗杂交(zjio)l底物显色 蛋白样品蛋白样品(yngpn)的制备的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳第3页/共32页第三页，共33页。基本基本(jbn)流程流程第4页/共32页第四页，共33页。蛋白样品(yngpn)的制备第5页/共32页第五页，共33页。制备制备(zhbi)流程流程n天然(tinrn)蛋白

3、：细胞总蛋白、组织总蛋白、膜蛋白、核蛋白n用细菌或酵母人工表达的蛋白破碎细胞提取蛋白高速离心蛋白定量Bradford法Lowry法第6页/共32页第六页，共33页。细胞细胞(xbo)(xbo)破碎破碎 1、液氮研磨法 2、机械匀浆法 3、超声波处理法 4、反复冻融法：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高(znggo)引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学裂解法：去氧胆酸钠、SDS 6、酶解法：细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理；植物 细胞壁可用纤维素酶处理。第7页/共32页第七页，共33页。蛋白蛋白(dnbi)提取提取 冰上操作冰上操作第8页/共32页第八页，共33页。蛋白蛋白(dnbi)

4、定量定量 蛋白上样量需达到一定的范围 保证开始实验(shyn)的总蛋白量是一致的第9页/共32页第九页，共33页。蛋白蛋白(dnbi)定量原理定量原理1. BCA（ bicinchoninic acid ）法）法在碱性条件下，蛋白将在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为还原为Cu+，Cu+与与BCA试剂形成紫试剂形成紫色的络合物，此物在色的络合物，此物在562nm波长处有最大吸收，颜色深浅波长处有最大吸收，颜色深浅(shnqin)与蛋白含量成正比。与蛋白含量成正比。2. Bradford法法考马氏亮蓝考马氏亮蓝G250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状

5、度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从色，最大吸收波长从465nm转移到转移到595nm处。处。3. Lowry法法蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生蓝色化合物，颜色深浅生蓝色化合物，颜色深浅(shnqin)与蛋白含量成正比。与蛋白含量成正比。第10页/共32页第十页，共33页。蛋白蛋白(dnbi)定量原理定量原理 4. 双缩脲法双缩脲法当需要快速，但不很准确的测定中，常使用双缩脲法。原理是当需要快速，但不很准确的测定中，常使用双缩

6、脲法。原理是Cu2+与蛋白质的肽键，与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。波长处有最大吸收。 5. 紫外吸收法紫外吸收法蛋白质溶液在蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大起的。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大(j d)误差，其最大误差，其最大吸收在吸收在260nm。所以同时测定。所以同时测定280及及260nm两种波长的吸光度，通过计

7、算可得较为正两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。确的蛋白质含量。第11页/共32页第十一页，共33页。基本基本(jbn)流程流程l转膜l封闭l一抗杂交(zjio)l二抗杂交(zjio)l底物显色 蛋白样品蛋白样品(yngpn)的的制备制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳第12页/共32页第十二页，共33页。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）SDS-PAGE凝胶配制 （2）样品处理： 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 （3）上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到胶加样孔内即可

8、。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳(50-60V)，而在溴酚蓝进入下层(xicng)胶时使用高电压恒压电泳（100-120V）。第13页/共32页第十三页，共33页。第14页/共32页第十四页，共33页。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：原理：浓缩效应：样品中蛋浓缩效应：样品中蛋白质被浓缩在浓缩白质被浓缩在浓缩胶和分离胶和分离(fnl)胶胶的界面。的界面。电荷效应：等电点不电荷效应：等电点不同，所带电荷量不同，所带电荷量不同，在电场中所受同，在电场中所受引力亦不同。引力亦不同。 分子筛效应：分子量分子筛效应：分子量大小或分子形状不大小或分子形状不同的蛋白质通过分同的蛋白

9、质通过分离离(fnl)胶时，所胶时，所受阻滞的程度不同。受阻滞的程度不同。第15页/共32页第十五页，共33页。第16页/共32页第十六页，共33页。转膜转膜膜的选择(xunz)硝酸(xio sun)纤维素膜PVDF膜尼龙(nlng)膜价格便宜易封闭，背景低极强的蛋白结合能力易破脆，不易操作信噪比高多用于核酸的转移，封闭较困难，背景高第17页/共32页第十七页，共33页。转膜方法转膜方法(fngf) 毛细管印迹法毛细管印迹法 滤纸、凝胶、膜、滤纸滤纸、凝胶、膜、滤纸 重物重物(zhn w)压住压住 毛细作用使缓冲液流过凝胶，将蛋白质带到膜上毛细作用使缓冲液流过凝胶，将蛋白质带到膜上 效率低（效

10、率低（1020） 电泳印迹法电泳印迹法 用有孔的塑料或有机玻璃板将凝胶和膜夹成用有孔的塑料或有机玻璃板将凝胶和膜夹成“三明治三明治”形状形状 湿转法、半干法湿转法、半干法第18页/共32页第十八页，共33页。转膜转膜 湿转法：湿转法： 将膜、胶叠层浸入缓冲液槽中然后加电将膜、胶叠层浸入缓冲液槽中然后加电压；压； 胶在负极，膜在正极；胶在负极，膜在正极； 慢，需要大体积冰预冷缓冲液；慢，需要大体积冰预冷缓冲液； 适用于分子量较大的蛋白；适用于分子量较大的蛋白； 半干法：半干法： 用浸透用浸透(jntu)缓冲液的多层滤纸代替缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽；缓冲液槽； 胶在负极，膜在正极；胶在负极，膜

11、在正极； 快（快（1545min）；）； 适用与小分子量蛋白；适用与小分子量蛋白；第19页/共32页第十九页，共33页。转膜步骤转膜步骤(bzhu)（湿转法）（湿转法）1、电泳完毕后，将膜和滤纸裁至与胶相同大小，并在胶上裁去一角做标记；2、将胶、膜、滤纸浸泡在转移缓冲液中平衡15min-30min（PVDF需先在100%甲醇中浸泡数秒钟）；3、打开夹板使黑的一面保持水平，按海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵垫的顺序叠放；4、赶走气泡后合起夹子。（膜两边(lingbin)的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路）将夹子放入转移槽中，夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。5、冰上 100V 35

12、0mA转膜1h，或30V 90mA转膜过夜。第20页/共32页第二十页，共33页。小型小型(xioxng)Trans-Blot 转印槽转印槽第21页/共32页第二十一页，共33页。半干转印仪半干转印仪第22页/共32页第二十二页，共33页。影响影响(yngxing)转膜效率的因素转膜效率的因素n转移缓冲液的平衡(pnghng)时间第23页/共32页第二十三页，共33页。影响影响(yngxing)转膜效率的因素转膜效率的因素SDSSDS有助于蛋白迁移到膜上，但过量的有助于蛋白迁移到膜上，但过量的SDS会抑制蛋白与膜的结合，会抑制蛋白与膜的结合，转印缓冲液中加入转印缓冲液中加入0.1会促进转印会促

13、进转印建议的步骤在转印缓冲液中不含有建议的步骤在转印缓冲液中不含有SDS，但凝胶在电泳后不需要浸泡，但凝胶在电泳后不需要浸泡在转印缓冲液中；凝胶中残留的在转印缓冲液中；凝胶中残留的SDS对于有效对于有效(yuxio)的转印已经足的转印已经足够。够。甲醇甲醇甲醇通过在蛋白上剥离甲醇通过在蛋白上剥离SDS促进蛋白和膜的疏水接合。活化促进蛋白和膜的疏水接合。活化PVDF膜上膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合；可降低蛋白质洗面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合；可降低蛋白质洗脱效率，增加蛋白质和脱效率，增加蛋白质和NC膜的结合能力。膜的结合能力。第24页/共32页第二十四页，共3

14、3页。影响转膜效率影响转膜效率(xio l)的因素的因素凝胶浓度：丙烯酰胺浓度越低，蛋白凝胶浓度：丙烯酰胺浓度越低，蛋白(dnbi)越容越容易转移。易转移。电压或电流电压或电流膜的选择膜的选择第25页/共32页第二十五页，共33页。第26页/共32页第二十六页，共33页。封闭封闭(fngb) 封闭未吸附蛋白的疏水结合(jih)位点，以减少非特异性结合(jih)背景的影响。 室温封闭1h-2h。 l 5%-7%脱脂奶粉（不适用于生物素亲和素检测和碱性磷酸酶底物检测系统）l 1%-3%BSAl 血清(xuqng)l 公司提供的WB封闭液第27页/共32页第二十七页，共33页。一抗二抗孵育一抗二抗孵

15、育(f y) 一抗：一般是用待测蛋白免疫动物A（如兔、鼠），获得的多克隆或单克隆抗体，如小鼠抗人NGF 二抗：另一种(y zhn)动物（如羊）的抗动物A的免疫球蛋白抗体（放射性标记或酶标记），如羊抗小鼠IgG/HRP抗原(kngyun)一抗二抗人NGF小鼠兔第28页/共32页第二十八页，共33页。一抗二抗孵育一抗二抗孵育(f y) 把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液(rngy)与膜温育。室温孵育1-2h，或4过夜。 倒掉一抗（用封闭液稀释），用1TBST洗膜3次，每次10min。 加入二抗（用封闭液稀释），室温孵育60-80min。 倒掉二抗溶液(rngy)，用1TBST洗膜3次，每

16、次10min。第29页/共32页第二十九页，共33页。显色显色(xin s) 酶联法：酶联法： HRP（辣根过氧化物酶）：底物为（辣根过氧化物酶）：底物为DAB，产生，产生(chnshng)红褐色。红褐色。 AP（碱性磷酸酶）：底物为（碱性磷酸酶）：底物为NBT/BCIP，产生，产生(chnshng)蓝紫色。蓝紫色。 底物化学发光底物化学发光ECL： 二抗中的二抗中的HRP或或AP与发光底物作用使其发光，然后经底片曝光显影记录下来。与发光底物作用使其发光，然后经底片曝光显影记录下来。 生物素标记生物素标记 地高辛标记地高辛标记 荧光标记荧光标记第30页/共32页第三十页，共33页。显色显色(x

17、in s)步骤步骤化学发光（化学发光（ECL），显影和定影），显影和定影将将A和和B两种试剂等体积混合，把膜移至一保鲜膜上，将混合液滴于膜两种试剂等体积混合，把膜移至一保鲜膜上，将混合液滴于膜上，室温孵育上，室温孵育2min后把膜放到另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入后把膜放到另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X光片夹中。光片夹中。暗室中，红灯下取出暗室中，红灯下取出X-光片，切纸刀剪裁适当大小。打开光片，切纸刀剪裁适当大小。打开X-光片夹，光片夹，把把X-光片放在膜上，关上。根据信号的强弱适当调整曝光光片放在膜上，关上。根据信号的强弱适当调整曝光(bo gung)时间。曝光时间。曝光(bo gung)完成后，取出完成后，取出X-光片迅速浸入显影液中显影，光片迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后终止显影。把待出现明显条带后终止显影。把X-光片放入定影液中定影至胶片透明光片放入定影液中定影至胶片透明为止。为止。第31页/共32页第三十一页，共3