第五章酶与细胞固定化技术

1、第五章 酶与细胞的固定化技术教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的范畴,半透膜包埋法。教学方法：讲授教学手段：多媒体第一节 概述一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差二、固定化酶研究克服游离酶缺点的方法之一50年代开始60年代后期，固定化技术迅速发展1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革三、基本概念1、固定化酶（

2、1971第一次国际酶工程学术会议）（Immobilized Enzyme) 指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。四、固定化酶优点增加了酶的稳定性能降低酶的总体费用酶的分离和回收变得容易，并可重复使用使反应过程的连续操作成为可能反应产物也易于提取纯化有利于过程设计和优化拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应

3、，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法一、酶的固定化方法1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法）一、酶的固定化方法2、选择方法依据： 酶的性质 载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 制备方法简便易行 衡量依据： 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； 研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； 稳定性和不稳定原因的探究； 对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。（一）吸附法1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固

4、定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。     此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白与一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用；缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的

5、固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的.4、常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。5、举例：将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM

6、NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS中备用。（二） 包埋法1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。 可分为凝胶包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高；缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。3、 海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转

7、移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒缺点: 在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定. Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解优点: 海藻酸盐价格便宜 包埋条件温和4、角叉菜糖包埋法 K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即生成凝胶.缺点: 对高浓度的Na+离子敏感 固定化温度高,需要在3755 5、聚丙烯酰胺凝胶 在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂N,N-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶缺点: 丙烯酰胺对酶具有变性作用6、聚乙烯醇（

8、PVA）包埋法 磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法硼酸硬化法: 将聚乙烯醇在70 80进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中优点: 原材料价格便宜 条件温和 无毒害作用 循环冷冻法 硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋。操作：酶液在油溶性表面活性剂存在下在水不互溶的有机相中乳化形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂帮助下由有机相移入水相。7、半透膜包埋法7.

9、2界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。例: 将含10%血红蛋白的酶液与1，6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盘-85的氯仿-环己烷中分散乳化，再加入溶于有机相的葵二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。（三） 交联法 基本原理：酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构，以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成席夫碱（基）Shiff 碱将酶固定化。含氨基的载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，还有乙撑二异氰酸酯

10、OCN（CH2）6NCO。交联剂的特点：带有二个以上的功能基团。反应比较剧烈条件比较严格。操作方便，活力回收不高。固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。交联法有5种形式：酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺乏选择性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高。酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度

11、，使酶与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，经-30低温处理，再预热至4而得泡沫状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。此法用于胞外酶的固定化较好，尤其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选择性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间的共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅

12、存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶装柱流动性能好，缺点是必须保证酶吸附在载体上。载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合物的单体反应，反应后再与酶一起共聚。交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好戊二醛交联法缺点： 双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。 为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交

13、联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白。（四） 化学共价法1、概念所谓共价法就是使酶蛋白的非必需基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通过共价键和不溶性载体形成不可逆的联接。要使载体与酶形成共价键，必需首先使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反应2、用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团: 1）氨基-赖氨酸上的-氨基以及多肽链N末端氨基酸上的- 氨基; 2）羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的- 羧基; 3）酪氨酸上的苯酚环; 4）半胱氨酸上的巯基; 5）羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基 6）组氨酸上的咪唑基; 7）色氨酸上的吲哚基其中

14、以氨基和羧基为最常用3、一般认为共价法的特点如下： 酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的半衰期较长。 制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构发生变化。 制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。 载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pH，浓度的改变。4、常用载体 天然高分子。如纤维素，葡聚糖凝胶（Sephadex），琼脂糖（Agarose Sepharose），卡那胶，淀粉以及它们的衍生物。（利用-OH） 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NH2） 无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。（要加上一个基团）5、 技术要点 将所选用的载体上的有

15、关基团活化，然后和酶蛋白上有关基团发生偶联反应。（直接活化或另接一反应基团） 在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。（接手臂）6、分类：重氮法； 叠氮法； 缩合法； 烷化反应法； 硅烷化反应法；溴化氰法。 重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，用这些载体制备了不少固定化酶。方法原理如下： 用双功能试剂 - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），连接于被活化（-OH）的纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。 在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。 把酶偶联于ABSE-纤维素上 叠氮法是在酶分子

16、与载体间形成肽键的固定化方法。主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下： 酯化：CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl 气体，进行酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥。 肼解:把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1 小时，过滤，甲醇洗涤干燥。 叠氮化:肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl 在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2 反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶，防止

17、戊二醛的另一醛再与载体上另一个-NH2 反应。(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg 酶），5搅拌2-3 小时，过滤用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存） 缩合法（对含-NH2,-COOH 载体的另一种方法）主要利用具有羧基或氨基的载体，加入到酶液中，在缩合剂碳化二亚胺（双环己基碳酰胺）作用下，使载体的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或 COOH 形成肽链而被固定。含羧基的载体有羧甲基纤维素，羧甲基交联葡聚糖等。含氨基的载体有氨乙基纤维素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。 烷基化反应法。将含有卤素官能团试剂与非水溶性的纤维

18、素载体进行烷化反应，然后和酶进行偶联制得固定化酶。一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。 硅烷化法：多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。这些多孔玻璃的孔径在2501000 埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1 克所拥有的表面积达100 平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热处理原子重组而成，是优良载体，但必须加以改造）。本法进行酶的固定化可分三个步骤： 将本体接上一个结合剂（也即硅烷化）； 接上功能基团； 把酶共价结合于载体。 溴化氰法-异脲键合法本方法主要用溴化

19、氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。上述这些载体在高pH 条件下（pH11 左右），溴化氰和多糖一类物质形成一种环化的活泼的亚氨碳酸盐，该化合物对蛋白质上的NH2 反应十分敏感，生成N-取代异脲，N-取代亚氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要产物为N-取代异脲，反应式如右：例：胰蛋白酶的固定-均在4时进行。 活化：称取琼脂糖凝胶100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl 和H2O 洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按1ml 沉淀

20、凝胶加入50300mgCNBr。立即用2N NaOH 调pH 值1011，维持pH 值11，pH 值不再下降，直到反应终止。反应在25通风橱内进行，反应仅需10 分钟，这样CNBr 将载体全部活化，生成活泼的亚氨碳酸盐。反应完毕后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCO3 洗涤（注意：切忌用带有-NH2 基的缓冲液来洗涤，因为亚氨碳酸盐对NH2-敏感，在酶偶联时，活性部位被NH2 占领，酶偶联不上），去除多余CNBr 和杂蛋白。 偶联：用偶联缓冲液（0.025M pH 10.2 硼酸缓冲液-0.02M CaCl2 或NaHCO3 平衡洗涤，抽干，加入5ml 缓冲液（内含16mg 酶）温度降至

21、4，搅拌反应4 小时，最后分别用0.1M pH8.5 硼酸缓冲液-1M NaCl 洗涤即成10.2M pH 4.0 醋酸缓冲液去除各种杂质第三节 细胞的固定化方法一、 吸附法同酶的方法，（1）酵母细胞带负电荷，在pH3-5的条件下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体表面，制成固定化细胞（2）霉菌的菌丝可吸附在多孔塑料、金属丝网等载体上来固定化（3）植物细胞可吸附在中空纤维外壁上固定化（4）动物细胞大多具有附壁生长特性，须依附在固体表面才能生长，可吸附在容器壁，微载体（颗粒细小的载体，直径100-200um）和中空纤维外壁等载体上来固定（培养液在中空纤维内流动）。二、包埋法同酶包埋法例：海藻酸钙-聚

22、赖氨酸（ALG-PLL）包埋技术 动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜柠檬酸钠溶液处理，使海藻酸钙凝胶溶解聚赖氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化 动物细胞。三、 原生质体固定化可解决胞内酶的生产利于氧的传递，营养成分的吸收一般采用凝胶包埋法包括原生质体的制备和固定两个步骤1 原生质体的制备要求：保持膜的完整性，不能使细胞内部的结构遭到破坏制备：对数期细胞的收集高渗溶液中加酶破壁分离除去细胞碎片、完整的细胞及酶（密度梯度离心）原生质体2 原生质体的固定原生质体等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质体悬浮液凝胶包埋角叉菜胶固定化 含渗透压稳定剂的缓冲液与角叉菜加热溶解

23、配成3%-8%的凝胶灭菌冷却到50左右与等体积的原生质体悬浮液混合均匀滴入到一定浓度的预冷的氯化钾溶液中球状的固定化原生质体2 原生质体的固定光交联树脂固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲液配制30%-60%浓度的光交联树脂预聚体，加热溶解后，在50左右，加入1%光敏剂，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，摊成薄层，经紫外光照射2-3mm，聚合后切成一定形状的小块，制成片状的固定化原生质体。第四节 固定化酶的评价 一、相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力,它与载体的体结构、颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率有关。相对酶活力低于75%的固定化酶,一般没有

24、实际应用价值。 二、酶的活力固定化的单位定义为：转化底物的量/固定化酶的单位重量（单位面积）/单位时间,单位是：mol/mg(cm2)/min。将酶进行固定化时,总有一部分酶没有与载体结合在一起,测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果。活力回收=固定化酶总活力/被固定化游离酶总活力×100%，或称偶联效率、活力保留百分数。一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果。 三、固定化酶的半衰期 即固定化酶的活力下降为初始活力一半所经历的时间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键，其测定方法与化工催化剂半衰期的测定方法相似,也可

25、以通过长期实际操作,也可以通过较短时间的操作来推算。 第五节 固定化酶的性质一、酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化，其原因可能是：酶的构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物或其他效应物的作用；底物和酶的作用受其扩散速率的限制。在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高。 二、酶稳定性提高酶稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对pH的稳定性、对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。三、最适pH值的变化 酶固定化后，催化底物的最适pH值和

26、pH活性曲线常发生变化，引起变化的因素主要有两个1、载体带电性质：载体带负电荷时，会吸引反应液中的H+，致使酶附近反映区域pH比周围反应液低，须提高反应液pH；反之，降低反应液pH。第五节 固定化酶的性质2、产物性质：由于载体的扩散障碍，产物为酸性时，产物积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域的pH降低，须提高须提高周围反应液pH；反之，降低周围反应液pH。四、最适温度的变化 一般情况下，固定化后的酶的最适作用温度与游离酶差别不大，但有时由于固定化方法和载体的影响，固定化酶的最适作用温度 可能降低，也可能升高，须加以注意，最适温度提高是有利的，可以降低酶的失活速率。五、 动力学常数

27、的变化(随载体性质变化)：由于分配效应：=Si微环境/S宏观环境对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程： 载体与底物带相同电荷，Si<S,则<1,Km>Km 固定化酶降低了酶的亲和力。 载体与底物电荷相反，静电作用，Si>S，>1,Km<Km六、底物特异性：对于作用于小分子底物的酶，变化不明显；但对于可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶来说，由于载体空间位阻作用，大分子底物难以接近酶分子而使催化速度大大降低，如固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽作用保持不变，对酪蛋白的作用仅为游离酶的3% 左右。第六节 固定化辅酶一、 辅酶固定化的意义辅酶类物质是一些“全酶”的组成成分，参与催化反应。同时当其与某些高分子物质结合时，可以大大提高催化效率。因