细菌的分离培鉴定

1、细菌分离培养及鉴定细菌的分离培养细菌的染色镜检细菌的生化试验一、细菌分离培养1、需氧菌的分离鉴定 细菌分离培养一般采取细菌分离培养一般采取“划线法划线法”，主要有分区划，主要有分区划线，十字交叉划线等方法，具体方法可按照个人习惯选择线，十字交叉划线等方法，具体方法可按照个人习惯选择应用，目的是达到使被检材料适当的稀释，以达到获得独应用，目的是达到使被检材料适当的稀释，以达到获得独立单在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鉴别其菌落性状立单在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鉴别其菌落性状。几种常见的划线方法几种常见的划线方法划线步骤划线步骤操作方法： 1 1、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指将平皿盖

2、揭、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指将平皿盖揭开呈开呈2020左右的角度；左右的角度； 2 2、右手持接种环，从混合培养物中沾取少许混合物涂布、右手持接种环，从混合培养物中沾取少许混合物涂布在培养基边缘，然后将接种环多余的混合物在火焰中烧灼在培养基边缘，然后将接种环多余的混合物在火焰中烧灼，待冷却后，再与所涂混合物的地方轻触，在空白区划线，待冷却后，再与所涂混合物的地方轻触，在空白区划线，后再烧灼，冷却后再在空白区划线，反复操作，直至混，后再烧灼，冷却后再在空白区划线，反复操作，直至混合物稀释到足够形成单菌落。合物稀释到足够形成单菌落。注意事项：a a 划线前先将接种环稍弯曲，使其和平皿内

3、琼脂面平行，不划线前先将接种环稍弯曲，使其和平皿内琼脂面平行，不致于划破培养基。致于划破培养基。b b 划线中尽量不要重复、往复划线，以免形成菌苔。划线中尽量不要重复、往复划线，以免形成菌苔。c c 划线接种完毕，在平皿底部写上菌名、日期和接种者等标划线接种完毕，在平皿底部写上菌名、日期和接种者等标记，然后倒扣培养记，然后倒扣培养。2、厌氧分离培养1 1、接种方法与需氧菌分离接种方法相同，仅培养条件发生、接种方法与需氧菌分离接种方法相同，仅培养条件发生变化。变化。2 2、厌氧培养方法主要有：二氧化碳厌氧法、生物学方法、厌氧培养方法主要有：二氧化碳厌氧法、生物学方法、化学方法、物理学方法等。化学

4、方法、物理学方法等。二氧化碳厌氧法：二氧化碳厌氧法：* * 简单的二氧化碳培养法可在盛放有培养物的有盖玻璃缸简单的二氧化碳培养法可在盛放有培养物的有盖玻璃缸内，燃点蜡烛，盖上玻璃缸盖，当火焰熄灭时，该缸内空内，燃点蜡烛，盖上玻璃缸盖，当火焰熄灭时，该缸内空气二氧化碳浓度大约增加了气二氧化碳浓度大约增加了5%5%10%10%。* * 化学方法生成二氧化碳，碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠化学方法生成二氧化碳，碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。与硫酸作用即可生成二氧化碳。* * 现在实验室设备中，已有二氧化碳培养箱，只需把二氧现在实验室设备中，已有二氧化碳培养箱，只需把二氧化碳的浓度

5、设置成所需浓度即可达到相应的厌氧环境。化碳的浓度设置成所需浓度即可达到相应的厌氧环境。生物学方法：生物学方法：* * 原理：利用培养基中含有的植物或动物组织消耗氧气的原理：利用培养基中含有的植物或动物组织消耗氧气的原理制成。植物或动物的组织具有呼吸作用，组织中的可原理制成。植物或动物的组织具有呼吸作用，组织中的可氧化物质也可以消耗培养基中的氧气。氧化物质也可以消耗培养基中的氧气。* * 植物组织包括马铃薯、燕麦、发芽谷物等；植物组织包括马铃薯、燕麦、发芽谷物等；* * 动物组织包括新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、动物组织包括新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等。心、脑等。* * 目

6、前比较常用的有厌气肉肝汤培养基、碎肉培养基等目前比较常用的有厌气肉肝汤培养基、碎肉培养基等。化学方法：化学方法：* * 原理：利用还原性比较强的物质将培养环境或培养基内原理：利用还原性比较强的物质将培养环境或培养基内的氧气吸收。的氧气吸收。* * 连二亚硫酸钠、碳酸钠和氧气反应生成硫酸钠、亚硫酸连二亚硫酸钠、碳酸钠和氧气反应生成硫酸钠、亚硫酸钠和二氧化碳，消耗环境中的氧气；钠和二氧化碳，消耗环境中的氧气；* * 每每100100立方厘米空间用立方厘米空间用1g1g焦性没食子酸及焦性没食子酸及10ml 10%10ml 10%氢氧化氢氧化钠或氢氧化钾，焦性没食子酸在碱性溶液中吸收大量氧气钠或氢氧化

7、钾，焦性没食子酸在碱性溶液中吸收大量氧气，生成焦性没食橙。，生成焦性没食橙。物理学方法：物理学方法：* * 原理：利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或原理：利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧环境，利于厌隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧环境，利于厌氧菌的生长。氧菌的生长。* * 常用的方法有厌氧罐法、真空干燥器法、高层琼脂法、常用的方法有厌氧罐法、真空干燥器法、高层琼脂法、加热密封法等。加热密封法等。3、纯培养与移植* *培养皿接种到斜面、单菌落接种到增菌肉汤、穿刺培养。培养皿接种到斜面、单菌落接种到增菌肉汤、穿刺培养。 培养皿接种到斜面

8、：右手执无菌接种棒，无菌条件下，左培养皿接种到斜面：右手执无菌接种棒，无菌条件下，左手打开平皿盖，用接种环挑取单菌落，立即取琼脂斜面小手打开平皿盖，用接种环挑取单菌落，立即取琼脂斜面小管，将管口火焰灭菌。右手小指夹住管塞拔出，将接种针管，将管口火焰灭菌。右手小指夹住管塞拔出，将接种针深入到待接小管中，从斜面底部开始划曲线，从下至上直深入到待接小管中，从斜面底部开始划曲线，从下至上直至斜面顶端为止。管口通过火焰灭菌后，盖好管塞。最后至斜面顶端为止。管口通过火焰灭菌后，盖好管塞。最后标注菌名、时间和接种者，置适宜条件培养。标注菌名、时间和接种者，置适宜条件培养。* *单菌落移植到肉汤培养基中增菌：

9、挑取单菌落过程如上所述单菌落移植到肉汤培养基中增菌：挑取单菌落过程如上所述，接种到肉汤小管内，置于适宜条件培养。，接种到肉汤小管内，置于适宜条件培养。* *穿刺培养：半固体移植采用穿刺法接种，方法基本与纯培养穿刺培养：半固体移植采用穿刺法接种，方法基本与纯培养接种相同，差别在用接种针挑取单菌落，垂直刺入培养基接种相同，差别在用接种针挑取单菌落，垂直刺入培养基内。内。注意事项：a a 接种环（针）火焰烧灼灭菌后要稍冷却后再挑取菌落；接种环（针）火焰烧灼灭菌后要稍冷却后再挑取菌落；b b 打开平皿，接种过程保持无菌状态，尽量靠近酒精灯燃心打开平皿，接种过程保持无菌状态，尽量靠近酒精灯燃心；c c

10、接种后，培养小管或平板要置于适宜条件，利于细菌生长接种后，培养小管或平板要置于适宜条件，利于细菌生长；d d 穿刺培养，接种针要直刺直出，不要反复戳刺；穿刺培养，接种针要直刺直出，不要反复戳刺；e e 芽孢菌耐杀灭，培养芽孢菌的实验室最好单独使用，否则芽孢菌耐杀灭，培养芽孢菌的实验室最好单独使用，否则要彻底灭菌。要彻底灭菌。二、细菌抹片的制备及染色1、细菌染色原理 由于细菌细胞结构和化学成分不同，因此具有毛由于细菌细胞结构和化学成分不同，因此具有毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用及离子交换、酸细管、渗透、吸附和吸收等物理作用及离子交换、酸碱亲和等化学作用。碱亲和等化学作用。 利用各种染料对细菌

11、细胞产生的各种物理、化学利用各种染料对细菌细胞产生的各种物理、化学作用，使其着色情况具有差异，便于镜检观察作用，使其着色情况具有差异，便于镜检观察。2、细菌抹片的制备a a 玻片准备：用玻片准备：用95%95%酒精浸泡或滴酒精浸泡或滴95%95%酒精酒精2 23 3滴，用洁净滴，用洁净纱布擦拭，然后在酒精灯外焰上拖过几次，若油渍比较顽纱布擦拭，然后在酒精灯外焰上拖过几次，若油渍比较顽固，可滴固，可滴1 12 2滴冰醋酸，用纱布擦拭后，在酒精灯外焰上滴冰醋酸，用纱布擦拭后，在酒精灯外焰上拖过几次。处理过的载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，拖过几次。处理过的载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后能

12、均匀展开，附着性好。滴上水后能均匀展开，附着性好。b b 抹片：抹片：液体材料：如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接液体材料：如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环沾取一环材料，在载玻片中央均匀涂布成适用灭菌接种环沾取一环材料，在载玻片中央均匀涂布成适当大小的薄层。当大小的薄层。非液体材料：如菌落、脓、粪便等，现用接种环取少量生理非液体材料：如菌落、脓、粪便等，现用接种环取少量生理盐水置于载玻片中央，然后在用灭菌接种环沾取少量材料盐水置于载玻片中央，然后在用灭菌接种环沾取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。组织脏器材

13、料：可先用镊子夹持中部，然后用灭菌剪刀剪去组织脏器材料：可先用镊子夹持中部，然后用灭菌剪刀剪去一小块，用其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成一薄层。一小块，用其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成一薄层。c c 干燥：一般采取自然干燥法。干燥：一般采取自然干燥法。d d 固定：火焰固定和化学固定固定：火焰固定和化学固定火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精灯外焰上火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精灯外焰上来回摆动几次，略加热，但不能太热，不烫手为宜。来回摆动几次，略加热，但不能太热，不烫手为宜。化学固定：血液、组织脏器的抹片做姬姆萨染色不用火焰固化学固定：血液、组织脏器的抹片做姬姆萨染色

14、不用火焰固定用甲醇固定。将已干燥的抹片浸入甲醇中定用甲醇固定。将已干燥的抹片浸入甲醇中2 23min3min，自，自然挥发干燥。然挥发干燥。3、细菌染色方法染色方法主要有革兰染色法、美蓝染色法、抗酸染色法、瑞染色方法主要有革兰染色法、美蓝染色法、抗酸染色法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法。氏染色法和姬姆萨染色法。以下以革兰染色法为例简要介绍操作方法。以下以革兰染色法为例简要介绍操作方法。革兰染色法：革兰染色法：* * 原理：机理仍不清楚，一般认为与细菌细胞壁的结构和化原理：机理仍不清楚，一般认为与细菌细胞壁的结构和化学成分有关。学成分有关。 革兰阴性菌细胞壁含有较多的脂类，当以革兰阴性菌细胞壁含有较

15、多的脂类，当以95%95%酒精脱色时酒精脱色时，脂类被溶去，使细胞壁孔隙变大，尽管酒精处理能使肽，脂类被溶去，使细胞壁孔隙变大，尽管酒精处理能使肽聚糖孔隙变小，但因为肽聚糖含量较小，细胞壁收缩有限聚糖孔隙变小，但因为肽聚糖含量较小，细胞壁收缩有限，故能让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被酒精洗脱出，故能让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。 革兰阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，酒精脱色时，革兰阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，酒精脱色时，细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫色染料复合细胞壁孔隙缩小到不

16、易让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色。物洗出细胞壁外，而被染成紫色。操作方法：操作方法：1 1、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，1 12min2min后，水洗；后，水洗；2 2、滴加革兰氏碘溶液于抹片媒染，作用、滴加革兰氏碘溶液于抹片媒染，作用1 13min3min后，水洗；后，水洗；3 3、滴加、滴加95%95%酒精于抹片上脱色，作用酒精于抹片上脱色，作用202030s30s，水洗；，水洗；4 4、滴加沙黄水溶液或石炭酸复红溶液复染、滴加沙黄水溶液或石炭酸复红溶液复染1min1min，水洗；，水洗；5

17、5、用吸水纸吸干或自然干燥，镜检；、用吸水纸吸干或自然干燥，镜检；6 6、结果，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色、结果，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。注意事项a a 制作抹片固定时温度不能过高，温度过高会使细胞壁中蛋制作抹片固定时温度不能过高，温度过高会使细胞壁中蛋白变性，染色中染液的渗出会有影响；白变性，染色中染液的渗出会有影响；b b 革兰染色法中，酒精浓度不能过高，也不能过低。此外，革兰染色法中，酒精浓度不能过高，也不能过低。此外，酒精脱色时间不宜过长，不要超过酒精脱色时间不宜过长，不要超过30s30s；c c 瑞氏染色法中，由于染料中有沉淀，所以要避免沉淀附着瑞氏染色法中，由于染料中有沉淀，所以要避免沉淀附着在抹片上影响镜检观察；在抹片上影响镜检观察；