二维电泳详细过程

1、北京六一仪器厂DYCZ-26C双向电泳系统检测报告技术部 吴承疆QQ:50894034实验原理：双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量等信息。实验方法：一

2、.实验材料:1.主要仪器和试剂（sigma,Ampholine购自GE）主要试剂超纯水（MiLiQ）、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、CHAPS（3-3-(胆酰氨丙基)二甲氨基丙磺酸内盐）、Ampholine（PH 3-10或4-7 5-8）碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid）、十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecylsulphate，SDS）、溴酚蓝(Bromophenol Blue)、低熔点琼脂糖、过硫酸铵(Ammon

3、ium Persulfate APS)、TEMED（四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；Tris碱、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸、甘油（丙三醇 glycerin ）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、蛋白质marker、蛋白定量试剂盒主要仪器DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、0.1毫克级电子分析天平、超声波细胞破碎仪、Millipore纯水仪(法国)、Eppendorf普通离心机、beckman高速冷冻离心机、瞬时离心机、恒温磁力搅拌器、UMAX扫描

4、仪(台湾)；恒温摇床、pH计、恒温振荡器等。 本次试验材料：动物组织二.实验试剂的配制样品裂解液尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65mM 0.098g（现加）每小管5毫克 2%Ampholine （40%） 0.5 ml（现加） 每小管25微升溴酚蓝 0.001% 10l （1% 溴酚蓝） MilliQ水 定容至10ml ，分装成20小管，每小管500uL，-20冰箱保存样品覆盖液（含8 mol/L尿素，1% Ampholine）取4.8g新鲜尿素（超纯），0.3 ml Ampholine，用去离子水定容至10mL，分装，每管含有100 uL，置于-20冰箱内保存

5、。胶条平衡缓冲液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl） 甘油 20% 20ml MilliQ水 定容至100ml 分装成10管，每管10ml，-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液I 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液II 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml（10% SDS

6、） 溴酚蓝 0.001% 100l（1%溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。第一向聚丙烯酰胺凝胶储液丙烯酰胺 7.09g甲叉双丙烯酰胺 0.405gMilliQ水 溶解后定容至 25 ml第二向30% 聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙烯酰胺 4g MilliQ水 溶解后定容至 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8 Tris碱 90.75gMilliQ水 400ml 用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDS SDS 10g MilliQ水 100m

7、l 混匀后，室温保存。10% Ap Ap 0.1g MilliQ水 1ml（用时加水溶解） 溶解后，4冰箱保存。10×电泳缓冲液 （1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3） Tris碱 30g 甘氨酸 144g SDS 10g MilliQ水 1L 混匀后，室温保存。第一向电极液母液（用前稀释10倍）正极电极液母液（0.1 mol/L磷酸）：取6.75mL磷酸用去离子水定容至1000mL。负极电极液母液（0.2 mol/L NaOH）：取16.48gNaOH，用去离子水定容至2000mL，置于4冰箱内可以保存2周。注意：正负极缓

8、冲液体系有多种，要分离不同PH范围的蛋白质，需要选择恰当的缓冲液体系。3.实验操作A.第一向IEF-PAGE 1.凝胶柱的玻管准备准备 干净玻管(17cm×2mm)内径1.5mm左右的，长度取18cm，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时，用双蒸水冲，(不能用自来水冲)，然后双蒸水泡至少1 个小时，中间换3，4 次水，最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干。用Parafilm封口膜封好底部，在15cm处作好标记,待用。 2.配制等电聚焦凝胶柱的制备（环境温度25）尿素（超级纯） 5

9、.5g第一向凝胶贮备液 1.33 mlAmpholine 0.5 ml 去离子水 1.97 mlCHAPS 0.2-0.4gTEMED 15l10%AP 50l 定容至10毫升注意：在加入TEMED和10%AP之前，先减压抽气10min，加入后立即准备装管（TEMED和10%AP的用量，不同的实验条件，需实验室自行摸索，以装管后2-4小时聚合为宜）3.灌制第一向凝胶将干净的玻璃管置于盛有凝胶液的烧杯中（插入凝胶液面下），玻璃管一端用封口膜或白色乳胶冒头密封住，用5mL针头从密封处插入，倒吸凝胶液于指定位置（约15厘米处）后，室温下竖直放置，待凝胶聚合后，在凝胶表面加入50l样品裂解液，再沿玻璃

10、管内壁小心注入50l水。放置1-2小时后吸去凝胶上层液体，再加入50l新鲜的样品裂解液，其上再覆盖0.02 mol/LNaOH电极缓冲液。4.预电泳下槽加0.01 mol/L磷酸电极液，上槽加0.02 mol/LNaOH电极缓冲液。下槽接正极，上槽接负极，打开电源，将电压分别调至200V、300V、400V分别15min、30min、30min进行预电泳，以去除未聚合的单体和杂质。5.加样和电泳（根据样品性质决定电泳时间，经验最重要）预电泳后，吸弃凝胶胶面的溶液，用微量注射器取样品液30l（约60-150ug蛋白），沿壁加在浓缩胶面上，注入时要慢，避免有气泡，在样品液之上小心加入样品覆盖液25

11、l，再加入上极缓冲液充满覆盖液上方的空隙，将电压先恒定400V-500V，电泳约16小时，再恒定电压1000V电泳约2小时。6.剥胶取下凝胶管，用局麻针头注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分开，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于编号的试管内，用蒸馏水冲洗几次。B.平衡取出胶条分别放入玻璃管中，用平衡缓冲液 I在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液 I；再用平衡缓冲液 II在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液 II，用去离子水冲洗2次（快速）。C.第二向SDS-PAGE1.玻璃准备未用过的玻璃和使用

12、过的粘有凝胶的玻璃都必须用3%的氢氧化钠溶液浸泡过夜才能使用，使用时先用水和清洁剂洗玻璃。用超纯水冲洗胶板，洗去清洁剂，然后用无水乙醇擦洗胶板。a、准备短玻璃胶板：1) 带上新手套，用镜头纸少量蘸取剥离硅烷溶液擦洗玻璃板每个角落。2) 5分钟后，用少量95%酒精浸湿镜头纸，在玻璃板上朝一个方向擦，然后垂直方向擦，重复擦洗2次。b、准备长玻璃板：1) 在准备长胶板前要换手套以避免交叉污染。2) 用浸透12 ml硅化剂溶液的镜头纸擦洗玻璃板每个角落。3) 在5分钟后，加2 ml 95%酒精在胶板上，用纸朝一个方向擦，然后垂直方向擦，重复擦洗2次。注意：所有的清洗用具必须分开在短胶板和长胶板上使用，

13、以免引起胶板的交叉污染。如果已经交叉污染了，凝胶序列可能会破缝或变散。2.凝胶配制及灌胶（1.0mm约80ml两块，1.5 约130ml 两块）在150ml烧杯中，配制100ml的12%的凝胶水 33 ml第二向凝胶储备液 40 ml1.5mol/L Tris碱 pH8.8 25 ml10%SDS 1 ml10%AP 0.5 mlTEMED 0.02 ml在加入TEMED和10%AP之前，先减压抽气10min，加入后立即准备装管（TEMED和10%AP的用量，不同的实验条件，需实验室自行摸索， 4小时聚合为宜）将玻璃板对齐，放置于制胶器中夹紧，防止胶液泄露，沿玻璃板上沿一侧缓慢注入凝胶液，防止

14、产生气泡，约2-3min灌好一块凝胶，在凝胶液表面加入约700l无水乙醇或正丁醇压胶，以防空气氧化，等待聚合。3.胶条的放置待凝胶聚合后，将平衡好的IEF胶条小心倒扣在硬塑料垫板上，由于胶条较软、易碎，以格齿作以辅助，帮助胶条转移至第二向凝胶上（切忌胶条与凝胶接合处不能有气泡）用配置好的低熔点琼脂糖（预先放置于微波炉中融化），密封住胶条与空气接触表面，防止氧化。4.电泳电泳条件：2W恒功率，时间大约30min左右，然后4W恒定功率，大约30min，最后调节至18W恒定功率，电泳4-6小时左右，当溴酚蓝到达胶底处即停止电泳。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色-银染一块胶的量：1.固定：过夜+10min

15、去离子水清洗×3   冰醋酸： 50ml 无水乙醇200 ml 定容至500 ml              洗胶：把经固定的胶板置于盛有500 ml双蒸水的塑料盘中清洗三次，每次10min。2.致敏：30min+10min去离子水清洗×3 硫代硫酸钠：1.57g 无水醋酸钠：34g 无水乙醇：157.5 ml 定容至500 ml洗胶：把经固定的胶板置于盛有500 ml双蒸水的塑料盘中清洗三次，每次10min3.染色

16、： 20min硝酸银： 1.25g 定容至500 ml                银染20min后，纯水洗1min2次（振荡混匀时，注意加遮蔽物以避光）。               4.显色：2-5min（可配置500×2瓶） 碳酸钠：25g 37%甲醛：0.2

17、ml 定容至1000 ml                1）.先用少量显色液快速洗去“黄褐色泥沙样”的背景杂质； 2）.再加入多量显色液，快速振荡，密切观察染色情况，尤其注意不可染过，及时加入终止液。5.终止显色：10min+30min清洗 7.3g的EDTA.2H2O 定容至500 ml洗胶：把经固定的胶板置于盛有500 ml双蒸水的塑料盘中清洗1次，30min MilliQ水摇晃清洗四，实验结果讨论： 从科学研究上分析，人类已经进入后基因组时代即蛋白组学的时代。 蛋白质组学是后基因组时代功能基因组研究的热点领域。蛋白质组学方法除了应用在微生物、肿瘤、神经系统、体液研究方面外，还广泛应用于植