猪塞内卡病毒编制说明

1、猪A型塞内卡病毒分离鉴定标准编制说明一、任务来源、标准制订的目的和意义1、任务来源根据四川省市场监督管理局关于下达2020年度地方标准制修订项目立项计划（第四批）的通知（川市监函2020560 号）第46号，由四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学负责制定猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范。（联系人：陈弟诗；联系电话2、背景塞内卡病毒A(Senecavirus A，SVA)又称为塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)，为小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员，现已证实SVA感染猪能够引发原发性水泡病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、

2、厌食、嗜睡和发烧等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎引起的临床症状难以区分。自2015年以来，在美国、中国、泰国等多个国家暴发了SVA疫情，造成了严重的经济损失。SVA由于近些年才被发现，其临床症状类似于口蹄疫，使得感染猪只的上市存在重大的风险。对于SVA这样的猪场新病，全世界对其认知都比较有限，其对于猪场的短期和长期影响难以确切估计。SVA在巴西、美国和我国几乎同时发生，说明其从被发现至今，或有进一步扩大和爆发的可能，而作为新出现的疾病，其潜在影响是不可估量的，不得不引起足够的重视。且目前该病并无成熟的商业疫苗及相关检测标准。因此，急需提出和制定针对该病原准确、有效、可行的分离鉴定标准

3、，这对我省乃至我国尤其是在非洲猪瘟常态化形势下，猪A型塞内卡病毒的检测、监测、流调、预警、风险评估、防控到净化有十分重要的意义。针对该病的不断扩散，急需提出和制定有效且准确的诊断标准。3、 任务性质：猪A型塞内卡病毒分离鉴定标准地方标准制订工作。4、 起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。5、主要起草人及其工作：姓 名单位名称职称/职务项目分工联系电话陈弟诗四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师主持，负责项目设计与实施，协调项目小组、标准内容的拟定、撰写、审核志文四川农业大学二级教授主持，负责项目设计与实施、协调技术专家、技术方法的建立、验证1398160

4、4765邵靓四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师主持，负责项目设计与实施，技术方法审核、复 斌四川省动物疫病预防控制中心推广研究员负责协调项目小组，方案、技术方法审定、审玲四川农业大学教授收集技术资料、技术方法的建立、验证、复核毅四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师调研、收集技术资料、技术方法试验、验证、复核、审超信四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师调研、收集技术资料、技术方法复核、审冬四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师收集技术资料、技术方法验证、复核、修订13

5、551008291邱明双四川省动物疫病预防控制中心兽医师收集技术资料、技术方法验证复核、修璐琪四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师调研、收集技术资料、技术方法复淳四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师收集技术资料、意见征询和修代芬四川省动物疫病预防控制中心高级兽医师技术方案审核、意见征询和修周四川省动物疫病预防控制中心兽医师收集技术资料、意见征询和修伟乐山市动物疫病预防控制中心高级兽医师技术方法验证、技术应用推凌遂宁市动物疫病预防控制中心高级

6、兽医师技术方法验证、技术应用推波绵阳市动物疫病预防控制中心高级兽医师技术方法验证、技术应用推烨巴中市动物疫病预防控制中心兽医师技术方法验证、技术应用推岗自贡市动物疫病预防控制中心高级兽医师技术方法验证、技术应用推秋霞雅安市动物疫病预防控制中心高级兽医师技术方法验证、技术应用推贤刚四川农业大学办公室主任调研、协调项目小组、意见征询彭珂楠四川农业大学兽医硕士撰写、技术方法的建立、试验、验证令华四川农业大学兽医硕士撰写、技术方法的建立、试验、验证

7、二、主要工作过程1、前期工作计划任务下达前，标准起草单位的科技人员对猪A型塞内卡病毒开展综合性调研，查阅、收集相关的文献、技术资料，并建立分离鉴定方法并进行重复试验，提出标准制定方案。2、成立标准制订项目小组2020年1月计划任务下达后，由四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学的专家、技术人员组成标准制订项目小组，对标准制订工作进行分工，明确任务和职责，以确保项目的顺利实施。3、资料收集和技术验证2020年2月至2020年9月，项目小组查阅国内有关猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范的资料，拟定标准内容、对标准中提出的技术方法方案进行讨论复核、对标准中建立的分离鉴定方法

8、进行充分验证核实。4、形成初稿2020年9月至10月，根据收集的相关技术资料、文献以及技术方法方案的验证核实，形成标准初稿；在初稿制定过程中，标准制订项目小组多次进行内部讨论，不断征求有关专家的意见，修改完善。5、完善草稿，形成送审稿标准初稿形成后，标准制订项目小组准备2020年11月至12月征求高等院校、科研院所、各市（州）农业农村和疫控中心的兽医专家、技术人员的意见，使之更符合规范，更切合实际，具实用性、操作性和指导性，并将收集的意见进行汇总处理，修改完善后形成猪A型塞内卡病毒分离鉴定标准送审稿。三、标准编制原则和主要内容确定依据1、编制原则遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，注

9、重标准的通用性、适用性和可操作性，同时符合我国国情。（1）以符合国家及地方相关法律、法规的规定为原则；（2）以符合已颁布的国家及行业等相关标准为原则；（3）本标准立足于猪A型塞内卡病毒最新研究成果，参考国内外猪A型塞内卡病毒分离鉴定资料，增强标准的科学性和先进性，其颁布、实施、应用有利于猪A型塞内卡病毒检测诊断、监测流调、预警预报和预防控制等，保障养猪业健康发展和公共卫生安全。（4）本标准通俗易懂，具有较强的可操作性和实用性。2、标准主要参数和检验规则等确定的依据本标准技术内容的依据如下：GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541-

10、2016 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范（农业部公告第503号）国家民航局关于运输动物菌毒种样本病料等有关事宜的通知（局发明电20084487号）3、主要内容及特点按照国家和行业标准格式和GB/T1.1-2009标准的结构和编写规则要求，本标准主要规定猪A型塞内卡病毒的分离材料、样本的采集、保存、运输和处理、细胞分离培养病毒、RT-LAMP核酸检测方法、判定标准等内容，其目的是规范猪A型塞内卡病毒的分离鉴定技术，达到标准化程度。特点：猪A型塞内卡病毒的分离与鉴定是该病毒诊断的确认性方法，也是塞内卡病毒病检疫、诊断和流行病学调查的重要方法

11、之一，其主要目的是：对疑似塞内卡病毒病猪进行确诊；对猪进行检疫，确定是否带有SVA；对发生的塞内卡病毒病疫情进行流行病学调查、追踪调查或回顾性调查；对新分离的SVA流行毒株进行基因分型鉴定和分子流行病学分析等进一步研究。该方法较免疫标记技术更加敏感。由于SVA在细胞培养过程中产生致细胞病变效应（CPE），因此病毒的分离鉴定可以通过在敏感细胞上培养并增殖，通过观察病毒在敏感细胞上产生的细胞病变效应（CPE），然后对在细胞培养中增殖的病毒采用RT-LAMP方法或RT-PCR扩增和序列测定来确认。该方法主要根据本实验室的成熟的操作程序，并参照参考OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册（2017年版）而形成

12、。方法详实，具有可操作性。4、 制定本标准的基础四川省动物疫病预防控制中心是四川省农业农村厅直属事业单位，主要负责全省动物疫病的预防、控制、扑灭工作。中心建有生物安全二级和生物安全三级实验室，具备国家检验检测机构资质认定资质，农业农村部兽医实验室考核合格。曾于2012年分离出四川省第一株蚊源盖塔病毒，鉴于中心职能职责，其能及时监测盖塔病毒流行情况并提供预测信息。中心近年国内外发表论文200余篇，编写四川省地方标准40余部。累计取得的部省级奖励12项，其中二等奖5项，三等奖7项。现有推广研究员7人，高级兽医师14人，兽医师14人；其中，博士8人、硕士18人，3人被评为四川省有突出贡献中青年专家，

13、已具备强大的人才阵容及完善的设施设备为该项目提供了强大的技术及硬件支撑。合作研究单位四川农业大学动物生物技术中心长期从事动物传染性疾病研究，在动物传染病研究中积累了丰富的经验，近年来共承担了国家973、863、国家科技支撑计划、国家自然科学基金等多个科研项目。在动物重大传染病的病原学、流行病学、伪狂犬病毒基因载体疫苗和配套分子诊断试剂的研究中取得了重大科技成果并形成了显著的特色和优势。获国家二类新兽药证书1个，国家发明专利1项，申报国家发明专利10余项，发表论文200余篇。以上研究成果为本项目的实施提供了强有力的技术支撑。四、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果（一）主

14、要试验或验证的分析本标准猪A型塞内卡病毒分离鉴定标准为新制定地方标准，对本标准中“猪A型塞内卡病毒细胞病变（CPE）观察结果”和 “猪A型塞内卡病毒RT-LAMP检测方法”的主要试验或验证的分析如下：1 细胞病变（CPE）观察结果SVA感染PK-15细胞后约36 h，出现典型的细胞病变效应（CPE），其特征为圆形，收缩和碎裂（如图1）。图1 SVV-SC-01株感染PK-15细胞36h后产生的细胞病变注：A 未感染PK-15细胞对照；B SVV-SC-01株感染PK-15细胞36h后产生的细胞病变；2 RT-LAMP检测结果2.1 引物的设计根据GenBank上已发表的SVA核酸序列(登录号:

15、 KY618836)，选择编码VP1蛋白的序列作为RT-LAMP的靶序列，运用Primer Explorer V4 软件设计一组引物，包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP，引物序列见表 1。表1 引物序列Table 1 Sequences of primers检测方法引物序列位置(53)RT-LAMPSVV F3CCGATCTCGACTACTGAATG28662886SVV B3GAGAACGCCACTGTCAGAC30173036SVV FIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC28812941SVV BIPTTCTAACACCCCGCCCAA

16、CA-TTGACGTACAGGCCGAAAC295330132.2 质控样本的制备和信息阳性对照：四川猪源SVV-SC-01株病毒液。阴性对照：无菌PBS缓冲液。2.3 特异性试验应用建立的RT-LAMP检测方法对SVA、FMDV、PRV 、PRRSV和CSFV进行检测，结果显示只有 SVA 阳性模板经 RT-LAMP扩增可见梯形条带。相反，其他病毒未出现条带，表明该RT-LAMP 检测方法具有较高的特异性，见图2。图2不同病原检测结果Figure 2 Detection of different pathogensM: DNA 分子质量标准；16: 分别为 SVA 、FMDV、PRV 、PR

17、RSV 、CSFV、阴性对照。2.4 敏感性试验图 3表明，RT-LAMP 在稀释度为1×101拷贝时仍可以检测到，而传统RT-PCR只能检测1×104拷贝数的核酸量。反应混合物中加入 SYBR Green I，荧光强度随病毒数量降低而降低，显色情况如图 3A。图3 RT-LAMP敏感性试验Figure 3 Sensitivity tests using the RT-LAMPA：LAMP-SYBR Green 显色；B：LAMP 电泳结果；C：RT-PCR电泳结果。M：DNA 分子质量标准；18：1×107拷贝1×100拷贝；9：阴性对照经上述研究表明

18、，该分离鉴定诊断方法具有以下优点：1)获得活病毒：此方法是获得活病毒十分重要的金标准方法；2)准确性高：对病毒含量较少的样品，需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性；3)灵敏性高：该RT-LAMP方法可检测到低至1×101拷贝数的样本，对SVA疫情进行流行病学调查、追踪调查或回顾性调查提供可靠检测方法。（二）预期的经济效果四川地区的生猪饲养量居全国前列。猪A型塞内卡病毒近年在四川地区开始流行，严重危害我省乃至我国的养猪业。因此，猪A型塞内卡病毒的监测和诊断是防控猪A型塞内卡病毒的重要措施。本制订标准中对猪A型塞内卡病毒的分离和RT-LAMP检测方法均进行了详细阐述，全面规范和标准化猪A型塞内卡病毒的分离鉴定技术，不但对猪A型塞内卡病毒的防控工作将起到重要的作用，还将产生极大的直接及间接经济效益。五、采用国际标准和国外先进标准的程度无六、与现行的法律、法规和强制性国家标准的关系本标准制定遵循GB/T1.1-2009、中华人民共和国动物防疫法、GB/T18088-2000、国家动物疫情测报体系管理规范、病原微生物实验室生物安全管理条例、动物检疫管理办法、农业部国家（行业）标准的计划编制、制定和审查管理办法等相关法律、法规规定。七